[发明专利]利用奇异变形杆菌制备生物絮凝剂的方法

权利要求书

1、利用奇异变形杆菌制备生物絮凝剂的方法，

A、菌种的斜面保藏及转种

先配置保藏菌种用的斜面培养基，其组分和含量g/L为：牛肉膏3～5，琼脂15-20，蛋白胨8～12，NaCl 4～6；将pH调整为7.0～7.2，并在115～121℃下灭菌20～30min；然后在无菌操作环境中，将奇异变形杆菌(Proteus mirabilis)接到斜面培养基上，在恒温培养箱中25～30℃下培养1～2天后，在冰箱内2～6℃下保藏；以后每过1个月将菌种转移至新鲜配置的斜面培养基上；

其特征在于：

B、种子液的制备

从冰箱中取出A步得到的新鲜配置的斜面培养基和转移在培养基上的菌种，移到恒温培养箱中25～30℃下培养1～2天后，再回冰箱内2～6℃下保藏，1～2天内取出，在无菌操作环境中，将斜面上的菌种转移至种子培养基中，种子培养基的组分和含量g/L为：葡萄糖18～22，尿素0.4～0.6，酵母膏0.4～0.6，K₂HPO₄ 4～6，KH₂PO₄ 1～3，NaCl 0.05～0.2，(NH₄)₂SO₄ 0.1～0.3，MgSO₄·7H₂O0.1～0.3，pH6.8～7.2；115～121℃下灭菌20～30min；将接种了菌种后的种子培养基放入摇床培养箱中培养，温度为25～30℃，摇床转速为150～170r/min，时间为2～3天，然后将其保藏在冰箱内，2～6℃下1～2天，备用；

C、液态生物絮凝剂的制备及絮凝率的测定

在无菌操作环境中，将种子液按1～2‰的比例接种至生产培养基中；生产培养基的组分和含量g/L为：葡萄糖8～12，蛋白胨0.8～1.2，MgSO₄ 0.2～0.3，K₂HPO₄ 4～6，KH₂PO₄ 1～3，其pH为6.8～7.2，并在115～121℃下灭菌20～40min；然后将接种后的生产培养基放入摇床培养箱中发酵，温度为25～30℃，摇床转速为120～140r/min，时间为1～2天得到菌种的生产培养基发酵液，该发酵液通过4000～6000r/min离心机离心分离20～40min，除去沉淀，上清液即为液态生物絮凝剂，测定絮凝率后将其保藏在冰箱内2～6℃下，备用；

D、生物絮凝剂的提取纯化

向液态生物絮凝剂中加入2～3倍体积的无水乙醇，在冰箱内2～6℃静置过夜，再用1000～4000r/min离心机分离20～40min；倾去上清液，往沉淀中加入2～3倍体积的无水乙醇，重复上面步骤1～3次；将沉淀物重新溶解于去离子水中，加入浓度为2％的十六烷基三甲基溴化铵，直至无沉淀产生，再经离心分离得沉淀物备用；将沉淀物重新溶解于2～3％的NaCl溶液中，加入2～3倍体积的无水乙醇，混合均匀，在冰箱内2～6℃静置过夜，离心得沉淀物，把沉淀物真空冷冻干燥得纯化的生物絮凝剂。

2、根据权利要求1所述的利用奇异变形杆菌制备生物絮凝剂的方法，其特征在于：所述的测定絮凝率是，向100mL比色管中加入0.4g高岭土，3mL的1％CaCl₂溶液和2mL离心上清液，然后加蒸馏水至100mL，盖上磨口塞，将比色管作10个上下的自然翻转，转速以每次翻转时气泡上升完毕为准，翻转结束后，静置5min，取比色管中50mL处的加入离心上清液处理后的高岭土悬液，用岛津UV—1700型紫外可见分光光度计在550nm的波长下测定吸光度A，同时以2mL新鲜的生产培养基代替离心上清液，进行与上述完全相同的操作，测其吸光密度B，实验作为对照，最后按常规的絮凝率E计算公式计算得到生物絮凝剂的絮凝率E%=B-AB×100,]]>式中A——加离心上清液处理后的高岭土悬液吸光度(A)；B——对照实验测得的吸光度(B)。