[发明专利]组织工程肌腱及其体外构建方法

说明书

技术领域

本发明涉及医学和生物医学工程领域，更具体地涉及应用真皮成纤维细胞和(或)脂肪来源细胞在体外构建组织工程肌腱的制备方法和用途。

背景技术

肌腱是连接骨骼肌肌腹与骨之间的致密胶原纤维结缔组织束，是骨骼肌的组成部分。肌腱的结构可以看成是肌肉的延续、退化部分。新鲜标本的肌腱呈银白色、索带状，质地坚韧。在松弛状态下表面有波纹，如果牵拉超过松弛状态的4％时，这波纹便消失，张力取消后波纹再现。在肌-腱联接处，胶原纤维进入肌内膜，附着在肌纤维的肌膜上在腱-骨连接处，腱束直接连续到骨和骨膜上，其中绝大部分胶原纤维进入骨，形成Sharpey穿纤维。肌腱传导肌腹收缩所产生的力，牵引骨骼，使之产生运动。肌腱本身不具有收缩能力，但能抵抗很大的张力。

肌腱缺损是目前临床工作中经常遇到的问题，对于肌腱缺损的治疗方法主要是：1、自体肌腱移植。2、同种异体肌腱移植。3、肌腱移植替代物。但以上方法均存在着某些弊端，自体肌腱移植存在肌腱供区缺乏的问题。新鲜的异体肌腱移植会引起严重的免疫排斥反应，经过冻干处理后的同种异体肌腱保存的仅仅是胶原纤维，将来仍需要自体肌腱细胞进行替代。人工肌腱替代物虽然近期生物力学强度较好，但远期终会发生降解，而且还会引起炎症、纤维化和肌腱粘连等反应甚至替代物排出体外。

上世纪80年代末期，组织工程学的兴起和蓬勃发展为解决这一难题提供了可能。曹谊林等于1994年首次报道了用聚羟基乙酸(PGA)短纤维在裸鼠皮下构建出了组织工程肌腱样组织。刘永涛等则在有完善免疫功能的鸡趾指屈肌腱原位，应用自体肌腱细胞构建组织工程肌腱成功，但是，应用自体肌腱细胞作为组织工程肌腱的种子细胞仍需切取较大的肌腱组织，造成新的损伤。因此，寻找新的种子细胞来源成为组织工程肌腱发展的首要问题。

此外，目前国内外组织工程肌腱的研究主要集中在动物体内的修复实验，即在体外扩增出足够数量的种子细胞，与生物材料复合后立即或仅在体外培养一至两周即植入体内缺损部位，尽管获得了一些初步的成功，但这种将接种细胞后的支架材料直接回植入体内形成肌腱的方式仍然存在一些重大缺陷：包括：(1)植入的是细胞材料复合物而非肌腱移植物，导致种子细胞存活不佳，从而引起移植失败，无法获取恒定的高成功率。(2)植入的支架为尚未降解的材料，其分解产物多为酸性，可以直接导致炎性反应，瘢痕形成和肌腱粘连，从而直接影响了肌腱的修复效果。(3)由于植入的是非肌腱移植物，随着材料的降解，细胞-材料复合物的力学性能大大降低，无法修复高张力部位的肌腱缺损。因此，虽然有较多的肌腱构建和修复的动物体内实验，但由于上述问题的存在，离临床应用仍有相当的距离。

由此可见，采用组织工程技术构建肌腱组织、修复肌腱组织缺损，并达到产业化生产的目的，关键之一是获取大量有正常功能的肌腱细胞。但是肌腱细胞经多次传代后丧失分泌基质的能力，难以获得大量有功能活性的肌腱细胞来修复大块缺损组织。关键之二是要构建出具有一定力学性能、大部分材料已发生降解的相对成熟的肌腱组织。因此，探索更广泛的种子细胞来源、更优化的体外构建技术已成为组织工程肌腱研究的焦点。

针对关键问题一，许多学者作了大量研究工作，试图拓展肌腱组织工程种子细胞来源，并促进其增殖。

第一，寻找可替代细胞例如骨髓基质干细胞(Mesenchymal stem cell MSC)、真皮成纤维细胞(Dermal Fibroblast DF)。MSC是一群具有多相分化潜能的细胞，在特定的诱导条件下可分化为多种间充质组织细胞，Awad等分离、培养MSC后与胶原复合形成细胞胶原复合物植入人工缺损髌韧带处，与对照组(单纯应用胶原)进行比较，发现实验组组织的弹性模量、最大张力、硬度等较对照组大，而在组织学和形态学方面两者并没有很大差别。然而，骨髓基质干细胞的来源有限，分离较为复杂。陈兵等人用猪的自体成纤维细胞成功构建组织工程肌腱并修复趾浅屈肌腱缺损，证明了真皮成纤维细胞作为组织工程肌腱或韧带构建的种子细胞的可行性。