[发明专利]果蝇抗菌肽的制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及生物领域，具体地说是涉及一种利用果蝇制备抗菌肽的方法。

背景技术

抗菌肽是昆虫浸染微生物等因素后在短时间内产生的抗菌物质。抗菌肽分子量较小，具有对热稳定、水溶性好、广谱抗菌等特点，而且与抗生素的抗菌机理完全不同，已成为新型抗菌、抗癌药物研究开发的目标，有着广阔的发展前景。

黑腹果蝇属于双翅目、果蝇科、果蝇属，它体形小，成蝇体长约0.5cm。雄性果蝇成虫腹部有7条环纹，有性梳。雌性果蝇成虫腹部有5条环纹，没有性梳。

果蝇繁殖快，生活周期分为卵→幼虫→蛹→成虫4个明显的时期。卵长约0.5mm、白色，前端背面的触丝能附着在食物或瓶壁上。卵经22～24h孵化为幼虫，幼虫约4～5mm，头部稍尖，有一黑色钩状口器。幼虫生活约4天左右化蛹，颜色淡黄、柔软，逐渐硬化变成深褐色，此时即将羽化成果蝇成虫。

果蝇喜好以腐败的水果等作为食物，从幼虫到成虫都生活在杂菌横生的污浊环境中，随时都有被病菌感染的机会，但它们却有着极强的适应恶劣环境的生存能力，预示着它们体内存在着独特的免疫防御机制，可能会产生抗菌肽。但长期以来由于人们对果蝇的研究往往偏重在遗传学上，又加果蝇个体小，故其经济价值未被深入开发，国内对其研究较少。

发明内容

本发明目的在于提供一种制备果蝇抗菌肽的方法。

本发明的技术方案为利用诱导培养的方法，用细菌或真菌诱导果蝇成虫产生抗菌肽。

具体做法为：用毛细针蘸细菌悬液，如金黄色葡萄球菌悬液，针刺果蝇腹部后培养；

或者将将果蝇置于含有真菌，如青霉的环境下培养。

将上述诱导后的果蝇加入Tris-HCl缓冲液，研磨果蝇至浆状，离心后取上清液，即得到果蝇抗菌肽。

经检测，本方法得到的果蝇抗菌肽对细菌和真菌有抑制作用。抗菌肽热稳定性较好，40℃、60℃、80℃和100℃处理10分钟仍保持抗菌活性。

自然培养的果蝇成虫体内不存在抗菌肽，通过本方法能诱导果蝇产生对细菌和真菌有抑制作用的抗菌肽。金黄色葡萄球菌能诱导果蝇产生抗菌肽，其抗菌肽不仅对金黄色葡萄球菌产生抗菌作用，也对大肠肝菌产生抗菌作用；青霉培养法诱导果蝇成虫产生的抗菌肽对青霉有抑制作用。该抗菌肽热稳定性较好，40℃、60℃、80℃和100℃处理10分钟仍保持抗菌活性。

具体实施方式

配制玉米粉果蝇培养基，121℃灭菌20min。用乙醚将原种瓶中的果蝇麻醉后，移入装有玉米粉培养基的培养瓶中，每瓶5对，25℃恒温培养。约7天后，用放大镜对果蝇幼虫和成虫的身体特征进行观察。

实施例1用金黄色葡萄球菌诱导抗菌肽

配制牛肉膏培养基121℃灭菌20min。划线法将大肠杆菌和金黄色葡萄球菌接种在牛肉膏培养基斜面上，37℃培养24h。

取1支金黄色葡萄球菌斜面，分别加入5ml生理盐水(0.9％NaCl溶液)，用接种针轻轻刮取菌体后移入无菌试管中，充分振荡，制成金黄色葡萄球菌菌悬液。

针刺法：乙醚麻醉果蝇成虫，用毛细针蘸金黄色葡萄球菌菌悬液后，针刺果蝇腹部。刺伤后的果蝇继续于25℃培养24h。

实施例2用青霉菌诱导抗菌肽

配制PDA培养基，121℃灭菌20min。划线法将青霉接种在PDA培养基斜面上，28℃培养4-5天。

培养法：乙醚麻醉果蝇成虫，移入长满青霉的培养瓶中，在25℃培养4-5天。

实施例3抗菌肽的提取

分别取实施例1和2诱导得到的果蝇成虫，乙醚麻醉果蝇成虫，称重，以20：1的比例加Tris-HCl缓冲液，研磨果蝇至浆状。提取液3500r/min离心10min，上清液4℃保存。

实施例4抗菌活性的检测

配制牛肉膏培养基和PDA培养基，121℃灭菌20min。划线法将大肠杆菌和金黄色葡萄球菌接种在牛肉膏培养基斜面上，37℃培养24h。划线法将青霉接种在PDA培养基斜面上，28℃培养4-5天。

各取1支大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和青霉斜面，分别加入5ml生理盐水(0.9％NaCl溶液)，用接种针轻轻刮取菌体或孢子后，移入无菌试管中，充分振荡，制成大肠杆菌菌悬液、金黄色葡萄球菌菌悬液和青霉孢子悬液。

(1)抗细菌活性：

取大肠杆菌和金黄色葡萄球菌菌悬液以及青霉孢子悬液各1ml，分别加入溶化而不烫手的100ml牛肉膏培养基和PDA培养基中，充分振荡后，倾倒入无菌培养皿中，每个培养皿约20ml。静置即得大肠杆菌检定板、金黄色葡萄球菌检定板和青霉检定板。