[发明专利]一种高效筛选单酶切基因表达载体的方法

说明书

技术领域：

本发明涉及生物工程领域，尤其涉及基因重组技术，特别涉及一种表达载体的构建和筛选方法，具体来说是一种高效筛选单酶切基因表达载体的方法。

背景技术：

基因重组技术是通过把目的基因重组至质粒或病毒等载体，转染或感染细胞，在细胞中表达目的基因和/或目的基因翻译的蛋白质的一种方法，该技术目前是研究基因或蛋白的常用方法之一。目前通过基因重组构建质粒或病毒载体时一般选用双酶切方法，该方法具有能定向克隆的优点，载体及插入片段在双酶切及连接后不需鉴定插入片段的方向性；但花费较大，选用的两种限制型内切酶的酶切效率可能相差较大，技术要求较高，且要在多克隆位点插入多个片段时可能找不到合适的酶切位点。单酶切方法仅用一种限制型内切酶，花费少，对技术的要求较低，在多克隆位点插入多个片段时可供选择的酶切位点相对双酶切明显要多；但是单酶切的缺点是不能定向克隆，连接后需测序鉴定是否存在插入片段及插入片段的方向是否正确，构建正确重组载体的概率小于50％，因此，测序的样本量至少是双酶切法的2倍，测序费用比双酶切法明显要多。

发明内容：

本发明的目的在于提供一种高效筛选单酶切基因表达载体的方法，所述的方法要解决现有技术中的双酶切方法构建重组载体选用的两种限制型内切酶的酶切效率可能相差较大，技术要求较高，且在多次克隆时可能找不到合适的酶切位点和花费高的技术问题，同时要解决单酶切方法构建重组载体不能定向克隆，构建正确的重组载体的概率低和测序花费高的技术问题。

本发明一种高效筛选单酶切基因表达载体的方法，所述的方法包括一个选择合适载体和限制性内切酶的过程，还包括一个利用限制性内切酶对载体进行酶切的过程，还包括一个选择插入基因片段的过程，还包括一个利用上述的限制性内切酶对所述的基因片段进行单酶切的过程，将单酶切酶切后的载体和单酶切酶切后的基因片段转化感受态细胞，根据理论上连接正确的重组质粒的基因序列为模板，以插入基因片段的载体的上序列设计上游引物，根据插入基因片段序列设计下游引物，进行菌落PCR，然后进行电泳，在菌落PCR产物电泳后出现的条带为正确构建的重组载体的菌落。

本发明的工作原理是：单酶切后载体及待插入片段均在两端形成黏性末端，连接后会有以下3种情况：

A.载体与插入片段连接且方向正确；

B.载体与插入片段连接但方向不正确；

C.载体自身连接；

以“载体与插入片段连接且方向正确(A情况)”的重组载体序列为模板，根据载体上的序列设计上游引物，根据插入片段序列设计下游引物；在菌落PCR时，正确构建的重组载体(A情况)转化的细菌由于存在DNA模板及相应的上、下游引物，因此PCR能扩增，电泳时可见条带。而“载体与插入片段连接但方向不正确”(即B情况)转化的菌落在PCR时由于插入片段的方向不正确，原先的下游引物此时相当于上游引物，即体系中缺失了下游引物，因此不能扩增出条带。而“载体自身连接”(即C情况)转化的细菌在PCR时没有下游引物结合的序列，因此也不能扩增出条带。因此，只要是PCR能扩增出条带的菌落就是转化有正确构建重组载体的菌落。

本发明和已有技术相比，其技术进步性是显而易见的。本发明充分利用单酶切方法在多克隆位点插入多个片段时可供选择的酶切位点相对双酶切明显要多的特点构建载体，转化细菌后使用特定设计的引物，根据菌落PCR的结果，直接筛选出正确构建的重组载体，从而明显减少测序费用，技术简单，容易推广使用，而且利用单酶切方法在限制型内切酶上花费也较少。由于采用双酶切法构建重组载体，往往也需菌落PCR鉴定，因此本发明并不会增加额外的费用，解决了采用单酶切方法筛选正确构建重组载体时测序费用比双酶切法明显要多的问题。即使双酶切法构建载体时不用行菌落鉴定，本发明的总费用也仅相当于1-2次的测序费用(也相当于1份限制型内切酶的费用)，较不用该方法时的花费明显减少。

附图说明：

图1是本发明采用限制性内切酶对载体进行单酶切后的示意图。

图2是本发明采用限制性内切酶对待插入片段进行单酶切的示意图。

图3是本发明采用限制性内切酶对载体进行单酶切后形成黏性末端的示意图。

图4是本发明采用限制性内切酶对待插入片段进行单酶切后形成黏性末端的示意图。

图5是本发明采用限制性内切酶对载体与插入片段进行酶切后连接且方向正确的示意图。

图6是本发明采用限制性内切酶对载体与插入片段进行酶切后连接但方向不正确的示意图。