[发明专利]褐牙鲆精子快速冷冻保存方法

说明书

技术领域：

本发明涉及海水鱼类精子保存方法。

背景技术

褐牙鲆(Paralichthys olivacens)俗称比目鱼，属鲽形目，鲆科、牙鲆属，是近海暖温性底层鱼类。其自然分布区主要是中国沿海、朝鲜、日本和俄罗斯的亚洲海区。其适应性强，生长快、个体大、肉质细嫩鲜美，并有消炎解毒、健脾益气等功效，是名贵的重要海水养殖品种之一。由于国际市场大量需求，从上世纪80年代末至90年代初，褐牙鲆遭到大量的捕捞，资源受到严重的破坏。为了弥补资源的不足和满足市场的需求，在上世纪90年代初，我国引进的欧洲一些品种如大菱鲆，已成为工厂化海水养殖的主要品种之一。而褐牙鲆是我国土族种，由于受到过渡捕捞和环境等因素的影响，种质资源越来越少。

现有大菱鲆、牙鲆精子的冷冻保存方法，该方法为：精子的稀释液为MPRS、TS-19、TS-2等完全人工配制；抗冻剂为10％浓度的二甲亚砜(DMSO)；降温方法液氮面上6cm处10分钟，液氮面上5分钟，进入液氮保存。精子活率最高70％。

褐牙鲆精子的冷冻保存关系到我国这种物种保护，但是目前还缺乏适合褐牙鲆精子快速冷冻保存的方法。现有技术用冰点渗透压仪首先测出精浆渗透压(mOsm/kg)，根据渗透压进行精子稀释液的配制，精子稀释液主要采用NaCl、KCl、葡萄糖等配制，要配制出适合于精子保存的稀释液需经过反复多次的实验才能获得；抗冻剂用二甲亚砜，二甲亚砜对精子的毒性作用较大，影响精子的保存效果；降温过程一般应用程序降温仪降温，需配备程序降温仪；保存容器为液氮罐。

发明内容

本发明需要解决的技术问题是提供一种操作简便，适合快速保存褐牙鲆精子，同时能获得较高精子活率的冷冻保存方法。

本发明的技术方案包括稀释液、抗冻剂、冷冻保护液配制，精子与保护液混合放入离心管中投入液氮中保存，其特征是将天然海水稀释，用稀释的海水激活精子，以不能激活精子的稀释海水作为保存精子的稀释液；采用浓度为14g/100ml乙二醇，或浓度为3g/100ml乙二醇+浓度为3g/100ml二甲亚砜作为抗冻剂；上述稀释液+抗冻剂作为冷冻保护液，将冷冻保护液在4℃的恒温箱预冷；精子与冷冻保护液按1:1或1:1.5或1:2或1:2.5或1:3比例均匀混合放入离心管中，将离心管置于液氮罐口下-20℃平衡1min，然后快速投入液氮中保存。

本发明用褐牙鲆生存环境的天然海水稀释作为褐牙鲆精子的稀释液，避免人工配制精子稀释液要经过多次反复实验才能确定各种离子成分和离子浓度的烦琐操作，同时人工配制的稀释液由于缺乏一些天然的微量元素，所以人工配制的稀释液不能完全满足保存精子的需要，对精子的保存效果不好，影响精子的成活率。现有技术精子保存采用的抗冻剂是二甲亚砜，而本发明用乙二醇(EG)作为抗冻剂添加到稀释液中作为抗冻保护液，保存褐牙鲆精子，使褐牙鲆精子冷冻保存后获得的成活率达到90％以上，成活时间达255s±13.45s。采用EG(3ml/100ml)+DMSO(3ml/100ml)两种抗冻剂作为组合抗冻剂，除可以获得较好的冷冻保存效果外(冷冻后精子的成活率达到90％以上)，两种组合抗冻剂还可以延长冷冻后精子的成活时间，成活时间长达540s±60s，比单用乙二醇保存的成活时间长285s。本发明通过液氮罐口下-20℃平衡1分钟，快速投入液氮保存，步骤简单，不需要昂贵的程序降温仪，同样达到较好的保存效果。野外操作时只需配带5-10升的液氮罐和一个保温瓶，就可以进行精子的冷冻保存，避免了目前野外采集到的精子必须带回实验室才能进行冷冻保存，精子采集时间过长或长途运输对精子的冷冻保存会造成很大的影响，直接影响到冷冻精子的成活率。

具体实施方式

本发明采用褐牙鲆生存环境的天然海水(其盐度为31)稀释，例如将盐度为31的海水稀释0.5、1、1.5、2、2.5、3倍，用稀释的海水激活精子，以不能激活精子的稀释海水作为保存精子的稀释液，经低温冷冻保存后，检测精子的成活率来确定最适合冷冻保存的稀释液，经实验选择稀释1倍海水最适合作为褐牙鲆精子的稀释液；通过不同抗冻剂、不同浓度对精子冷冻保存效果的比较，确定乙二醇(EG)作为抗冻剂，浓度为14g/100ml，或EG(3g/100ml)加DMSO(3g/100ml)作为抗冻剂添加到稀释液中作为褐牙鲆的低温冷冻保护液，将冷冻保护液置于4℃下预冷，将预冷过的保护液取出，精子与保护液可按1:1、1.5、2、2.5、3的比例稀释，按1:15比例稀释的效果最好，将稀释好的精子装入200μl的塑料离心管中，置于液氮罐口下-20℃平衡1分钟，然后将其快速投入液氮保存；解冻时离心管快速从液氮中提出，置于38℃水浴中解冻。采用本方法冷冻保存褐牙鲆精子，冷冻后精子的活率达90％以上。该方法与保存大菱鲆、牙鲆的方法比较，冷冻后精子的活率提高20％以上，是目前淡水和海水鱼类精子冷冻保存后获得精子活率最高的方法。