[发明专利]尿沉淀DNA甲基化谱式分析诊断膀胱癌的方法和试剂盒

说明书

技术领域

本发明涉及通过检测从正常(亦可非膀胱癌者)和膀胱癌(包括癌前阶段)个体的尿沉淀中基因的启动子区CpG岛中特定序列的甲基化谱式的差异来诊断膀胱癌的试剂盒和方法。 

背景技术

人类和越来越多的模式生物基因组全测序的完成使对发育和疾病过程中基因组成和功能阐明进入了新的以对非DNA序列的为基础的表观遗传学信息层面的分析和诠释为中心的时代。表观遗传由DNA甲基化(胞嘧啶[CpG]甲基化)，非编码RAN，组蛋白修饰和染色质重塑所组成。该信息界面介于存储的遗传蓝图基因组DNA序列和表达模式决定的表型性之间。与遗传物质相比，它更容易受到环境的影响[1]。5’-CpG-3’序列中的胞嘧啶环(图1)上的甲基的添加是由三种DNA甲基转移酶(DNMT1，DNMT3a，和DNMT3b)中的一种以S-腺苷甲硫氨酸作为甲基的供体来实现的。亲本细胞中的甲基化谱式可以一种类似遗传信息的半保留复制机制的形式被如实地复制并且分配到子细胞中。甲基化是决定转录层面的记忆的关键机制。在早期胚胎细胞发育和生殖细胞成熟过程中(表观遗传的改编过程)两次重大变化期之间，DNA甲基化谱式的变化持续发生在整个个体生命过程中持续发生。表观遗传状态的稳控机制的异常会导至表观遗传损伤的积累，最终将导致包括癌症在内多种疾病[2]。 

癌症是一受累于广泛的表观遗传缺陷和遗传缺陷的复杂疾病。这些缺陷模式随疾病和患病个体的不同而迥异[3]。DNA甲基化是建立在酶促反应的基础上在5’-CpG-3’二核苷酸回文序列内的胞嘧啶的五号碳原子上加上甲基(DNA甲基化)(图1)，是研究的最为清楚且是癌症表观遗传研究的焦点。 

85％以上的CpG二核苷酸散布位于具有转录依赖性的转座潜能的重复序列中。在正常细胞中，它们处于高度甲基化/转录沉默的状态，是基因组的完整性所必须。肿瘤细胞基因组的广泛低甲基化的状态，导致重复序列的转录、转座活动上扬[2，4]，继而基因组的非稳定性和原癌基因转录增强[5，6]。其余的CpG成 簇的分布于短的DNA区域(长度大约在0.2到1kb)，被称为“CpG岛”。约40-50％的基因在启动子区域或其附近有CpG岛，提示该类基因的转录可受着DNA甲基化介导的机制的调控。在正常细胞中它们多处于未甲基化的状态，但是，在肿瘤细胞中处于高度甲基化的状态导致的抑癌基因，DNA修复基因，细胞周期控制基因，抗凋亡基因等的转录沉默。 

在癌症发生早期表观遗传异常的重要作用可表现为遗传印记丢失(LOI)。如，遗传印记基因IGF2基因的过表达则会促进细胞增殖，它的LOI可见之于结肠癌患者的正常的结肠上皮细胞，若其在循环的白细胞发生是患结肠癌的易感者的重要特征[7]。抑癌基因和DNA修复基因的高甲基化/转录沉默是一很常见的癌前病变的现象[8，9]。例如，在肺癌被诊断前的35周时，在痰中的DNA中可以检测到的p16ink4A(抑癌基因)和MGMT(DNA修复基因)高度甲基化[8]。表观遗传状态异常也可导致干细胞的不正常增殖，继而促进癌症形成。H.pyrio感染和一些特定基因的异常甲基化之间有关系提示DNA甲基化状态的检测有一定的预警作用[10]。因此，对高危人群的外周DNA(血清，大便，痰和尿沉淀作为样品源)甲基化分析的肿瘤预警价值已被提到议事日程。最后，DNA甲基化谱式的异常可发生在癌症的任一阶段(异性增生，良性，局部和转移灶等)，可用于肿瘤分子分期和分型。