[发明专利]一种提高RTN4B蛋白产量的方法

说明书

技术领域

本发明涉及基因工程领域，具体地，发明涉及一种新的提高RTN4B表达量的技术手段和方法。

背景技术

RTN家族是一个近年来所发现的新的基因家族。其中神经内分泌特异性蛋白NSP(neuroendocrine-specific protein)后被统一命名为RTN1，是该家族的第一个成员。根据NSP基因组序列、cDNA序列和核酸序列数据库比较，发现了另外三个人RTN家族成员(NSP类基因I，II，III)。其中两个(NSP-like基因I，II)相继被克隆，并被命名为RTN2和RTN3。RTN4类似于RTN1和RTN2，同样有C-末端相同的三个异构体(即RTN4A，4B，4C)。RTN4异构体与RTN1/NSP，RTN2，RTN3异构体一样有着共同的C-末端，并且四者的C-末端都有高度同源性。

研究表明，RTN4B广泛存在于人的各个组织之中(肝脏除外)可以明显促进鸡胚尿囊膜处和小鼠角膜处的血管增长。创伤愈合实验表明，人RTN4B蛋白可明显促进创伤愈合，包括增强细胞的粘附力。RTN4B蛋白可以用于促进创伤处血管愈合，可以作为创伤愈合药物，尤其是血管生长促进药物。

发明内容

本发明的目的是提供一种提高RTN4B蛋白产量的方法。

本发明提供了一种提高RTN4B蛋白产量的方法，它包括使用DFO或者氯化钴等类似缺氧条件的方法提高RTN4B的表达量。

本发明提供了一种提高RTN4B蛋白的产量的方法，即在组织或者细胞的培养环境中加入去铁胺或者氯化钴，加入的量为1-500μM(即μmol/L)，处理时间在6小时以上。

本发明中，使用加入50-250μM的去铁胺的方法提高RTN4B的产量，处理时间为12-48小时。

本发明中，使用加入50-250μM的氯化钴的方法提高RTN4B的产量，处理时间为12-48小时。

本发明中，去铁胺的用量可以为90-120μM。

本发明中，氯化钴的用量可以为75-110μM。

本发明中，DFO是去铁胺(例如，sigma，D9533)，CoCl₂是氯化钴(例如，sigma，232696)。

本发明中，“组织或者细胞的培养环境”是指常规的培养环境。例如，在37℃、CO₂含量5％(体积比)的培养箱环境中培养细胞。

本发明中，术语“RTN4B蛋白”指可促进创伤愈合的、序列与NCBI登陆号AAG12177所示多肽序列至少70％同源性的RTN4B多肽及其变异形式。这些变异形式包括(但并不限于)：若干个(通常为1-50个，较佳地1-30个，更佳地1-20个，最佳地1-10个)氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加一个或数个(通常为20个以内，较佳地为10个以内，更佳地为5个以内)氨基酸。例如，在本领域中，用性能相近或相似的氨基酸进行取代时，通常不会改变蛋白质的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加一个或数个氨基酸通常也不会改变蛋白质的功能。该术语还包括人RTN4B蛋白的活性片段和活性衍生物。

该多肽的变异形式包括：同源序列、保守性变异体、等位变异体、天然突变体、诱导突变体、在高或低的严紧度条件下能与人RTN4B DNA杂交的DNA所编码的蛋白、以及利用抗人RTN4B多肽的抗血清获得的多肽或蛋白。本发明还提供了其他多肽，如包含人RTN4B多肽或其片段的融合蛋白。除了几乎全长的多肽外，本发明还包括了人RTN4B多肽的可溶性片段。通常，该片段具有人RTN4B多肽序列的至少约10个连续氨基酸，通常至少约30个连续氨基酸，较佳地至少约50个连续氨基酸，更佳地至少约80个连续氨基酸，最佳地至少约100个连续氨基酸。

本发明还包括人RTN4B蛋白或多肽的类似物。这些类似物与天然人RTN4B多肽的差别可以是氨基酸序列上的差异，也可以是不影响序列的修饰形式上的差异，或者兼而有之。这些多肽包括天然或诱导的遗传变异体。诱导变异体可以通过各种技术得到，如通过辐射或暴露于诱变剂而产生随机诱变，还可通过定点诱变法或其他已知分子生物学的技术。类似物还包括具有不同于天然L-氨基酸的残基(如D-氨基酸)的类似物，以及具有非天然存在的或合成的氨基酸(如β、γ-氨基酸)的类似物。应理解，本发明的多肽并不限于上述例举的具有代表性的多肽。

本发明中，可以将RTN4B蛋白与药学上的载体或者赋形剂组成的促进创伤愈合的药物组合物。本发明中，所述的创伤愈合药物是血管生长促进药物。