[发明专利]肥厚型心肌病的PRKAG2基因突变及其检测方法

说明书

技术领域

本发明属肥厚型心肌病的基因突变及其检测方法领域，特别是涉及PRKAG2基因突变及其检测方法。

背景技术

肥厚型心肌病(HCM)是以左心室和/或右心室及室间隔非对称性肥厚为特征，临床表现多样，从无症状到黑朦、晕厥、心绞痛、严重心衰以至猝死，现已明确HCM是年轻人心源性猝死最常见的病因，我国成人的患病率为80人/10万(2004年)。

至今，HCM病因和发病机制尚不十分清楚，流行病学资料表明，大约50％的HCM患者呈家族聚集性，遗传因素在其发病过程中起非常重要作用。随着分子生物学的迅猛发展和人类基因组计划的完成，心肌病的致病基因研究取得了很大进展，迄今为止，已确定了10个编码肌节蛋白基因的200余种突变，可引起单纯性HCM，不伴有其他心脏表现和心脏外表现，其中最常见的三种突变类型是β-肌球蛋白重链基因(MYH7)、肌球蛋白结合蛋白C基因(MYBPC3)和心脏肌钙蛋白T基因(TNNT2)，占家族性肥厚型心肌病的70-90％。

另外，编码非肌节蛋白的致病基因的发现，促使了从新的角度探讨HCM的发病机制。已发现的非编码肌节蛋白基因包括编码肌肉LM蛋白(CRP3)、钾离子电压门控通道(KCNQ4)、腺苷酸单磷酸活化蛋白激酶的γ-2调节亚单位(PRKAG2)、线粒体DNA(MTTI)、线粒体转运蛋白(FRDA)、及溶酶体相关膜蛋白2(LAMP2)基因。与编码肌节蛋白致病基因突变不同的是，这些基因突变除导致心肌肥厚外，多伴有其它心脏表现或心脏外表现如扩张型心肌病、先天性耳聋、预激综合征、糖尿病及神经肌肉病变等。

2001年，Gollob第一次报道PRKAG2基因突变与家族性心肌肥厚合并传导系统异常及心室预激发病有关，家系内的患者都存在PRKAG2突变，而家系正常人员无PRKAG2突变。此后国外陆续有相似家系报道，并证实这类家系临床表现可能与PRKAG2基因突变有关。迄今为止，国外共有17个家族性心肌肥厚合并传导系统异常及心室预激家系PRKAG2基因突变的报道，另外在该疾病的少量散发病例中也检测到PRKAG2基因的突变。这些结果显示，PRKAG2基因突变可能与家族性心肌肥厚合并传导系统异常及心室预激的发病有关。

鉴于遗传背景和环境因素的共同作用，HCM的致病基因及突变位点在不同国家、不同种族之间的分布差异很大。而HCM心肌病已成为影响我国居民身心健康及人口生存质量的重大公共卫生问题。但是国内有关中国人HCM的遗传学研究存在明显不足，未见有对中国人汉族心肌肥厚合并传导系统异常及心室预激家系的相关致病基因分析

发明内容

本发明的目的是提供肥厚型心肌病的PRKAG2基因突变及其检测方法，明确了中国人家族性心肌肥厚合并传导系统异常及心室预激发病的分子遗传学机制。

本发明的肥厚型心肌病的PRKAG2基因突变是指在PRKAG2基因第3外显子上第298位碱基发生G→A杂合突变。该突变导致编码的第100位氨基酸发生由甘氨酸(G)到丝氨酸(S)的错义突变。

本发明的肥厚型心肌病的PRKAG2基因突变检测方法，包括下列步骤：

(1)提取外周血DNA；

(2)PRKAG2基因外显子的体外PCR扩增；

(3)DNA测序分析。

所述的PCR扩增是指反应液为2μL10×PCR Buffer、0.3μl的20μM引物、0.6μl10mM dNTP mix、1.2μL 25mM MgCl₂、1U Taq酶，力口ddH₂O至20μl，20ng/μl DNA模板1μl，反应条件：95℃15分钟；94℃40秒，63℃1分钟，每个循环减0.5℃，72℃延伸，共10个循环；然后变性94℃40秒，退火57℃ 1分钟，延伸72℃，共30个循环；72℃延伸10分钟。

所述的测序反应中的PCR反应体系包括测序引物、PCR纯化产物和荧光测序MIX，反应条件：94℃10秒预变性，94℃10秒，63℃5秒，68℃4分钟，35个循环，56℃延伸4分钟；

所述的PRKAG2基因外显子的PCR和测序引物序列见表1。

表1 PRKAG2基因外显子PCR和测序引物序列

本发明的有益效果是遗传性的家族性心肌肥厚合并传导系统异常及心室预激家系中无症状基因突变携带者在疾病发生前的早期诊断只能依赖于基因筛选。

附图说明

图1心肌肥厚合并传导系统异常及心室预激家系图谱

图2是Polyphred软件对多个序列进行比较发现SNP的图谱，红色表示可能的SNP；