[发明专利]一种利用FPLC测定脱氧胞苷激酶(dCK)活性方法

说明书

技术领域

本发明属于一种酶活力测定方法，具体涉及一种脱氧胞苷激酶(dCK)的酶活测定方法。

背景技术

脱氧胞苷激酶(dCK)是细胞质内的四大激酶之一，它广泛存在于哺乳动物体内及一些细菌细胞内。细胞体内，dCK可以催化天然核苷的磷酸化，也可催化一些核苷类药物的磷酸化。研究表明，抗病毒核苷类药物在人体内通过dCK催化进行磷酸化，产生与逆转录酶结合的底物，而发挥药效。但是，在一些患者体内细胞的dCK含量很低，无法催化核苷类药物的磷酸化，因而导致了病毒的抗药性。因此，利用从各种来源提取dCK，并将其用于核苷类似物的体外磷酸化，对核苷类药物的发展来说是一个崭新的领域。故对于从各种来源纯化的dCK进行酶活表征，是利用dCK进行催化反应的重要步骤。

自1970年以来，有多个专家对于dCK的酶活测定方法进行了研究，主要有：放射性同位素薄层层析色谱法、放射性同位素连续分光光度法以及非放射性反相HPLC色谱法。其中，放射性同位素薄层层析色谱法的发明年代较早，对现代实验室测量来说是落后且费时的；放射性同位素连续分光光度法虽然是第一种方法的改进，但是同样也需要用到放射性同位素，大大增加了时间上和经济上的成本；而非放射性反相HPLC色谱法是2004年发表的利用高效液相色谱进行dCK酶活测定的一种新方法，简单易懂，简化了以往的复杂操作，但是其对液相色谱柱要求较高。通过实验发现，应用非放射性反相HPLC色谱法，在相同条件下进行两次实验，所得的结果存在差异，实验重复性不够。

发明内容

本发明的目的是提供一种脱氧胞苷激酶(dCK)酶活测定方法，该方法克服了以往的dCK酶活测定方法的繁琐，耗时较长，重复性不高的缺陷。

本发明的利用蛋白质层析系统(FPLC)测定dCK酶活的方法，包括如下步骤：

(1)将反应混合液放入气浴/水浴恒温振荡器中反应后，加入冰甲醇终止反应，冰浴后，离心，取上清液；

(2)用Tris-HCl缓冲液稀释上清液，过滤，利用FPLC的反相液相色谱柱进行层析，通过与空白对比测得CdA减少的量，计算dCK的活性。

所述步骤(1)中的反应液包括：2-氯-2-脱氧胞苷(CdA)、三磷酸尿苷(UTP)、氯化镁MgCl₂、氯化钠NaCl、氟化钠NaF、二硫代苏糖醇DTT、dCK，浓度分别为0.1～1mmol/LCdA、1～10mmol/L UTP、1～10mmol/L MgCl₂、10～20mmol/L NaCl、10～20mmol/L NaF、1～2mmol/L DTT，优选1mmol/L CdA、10mmol/L UTP、10mmol/L MgCl₂、20mmol/L NaCl、20mmol/L NaF、2mmol/L DTT。

所述步骤(1)中的反应液用0.005～0.02mol/L的Tris-HCl(pH6.0～8.0)溶液定容，优选0.01 mol/L的Tris-HCl(pH7.4)；

所述的脱氧胞苷激酶(dCK)是指从小牛胸腺中提取的dCK；

所述步骤(1)中的反应是指30℃～40℃，120～150转条件下，反应2～3小时，反应后冰浴5～20分钟，优选37℃，摇床转速为150转，反应时间为2小时，反应后冰浴10分钟；

所述的步骤(2)中的层析条件是反相液相色谱柱为RESOURCE^TM RPC 1ml，洗脱液A为0.05～0.02mol/L的Tris-HCl缓冲液(pH6.0～8.0)，洗脱液B为乙腈，平衡为5～10个柱床，冲洗为5～7个柱床，洗脱梯度为洗脱液B在10～20个柱床内由0％线性增加至100％，流速为1～2ml，优选洗脱液A为0.01mol/L的Tris-HCl缓冲液(pH7.4)，平衡为10个柱床，冲洗为7个柱床，洗脱梯度为洗脱液B在20个柱床内由0％线性增加至100％，流速为1ml；

所述的dCK酶活的计算方法：dCK酶活U＝CdA反应量(picomol)/蛋白含量(μg)·h，CdA反应量＝CdA空白标准量-CdA剩余量；

所述的CdA剩余量的测定为内标法。

本发明提供的方法快速、简便，结果可信，重复性高，为大批量测定氧胞苷激酶(dCK)酶活，提供依据。

附图说明

图1为用快速蛋白质层析系统(FPLC)对小牛胸腺dCK催化CdA磷酸化反应混合液空白进行反相色谱层析所得的色谱图；

图2为用快速蛋白质层析系统(FPLC)对小牛胸腺dCK催化CdA磷酸化反应混合液进行反相色谱层析所得的色谱图。