[发明专利]土鳖干粉提取物的制备及其应用

说明书

技术领域

本发明涉及中药，具体涉及从土鳖虫干粉中提取镇痛有效部位的工艺，以及由该 提取工艺所得到的一系列多肽组分，以及该多肽组分在制备镇痛药物中的应用。

背景技术

疼痛不仅是许多疾病的并合症，而且已经被看作是一类疾病。从疾病层面上讲， 由各种各样的疼痛造成的生活质量下降波及了最大量的人群。由于有效的镇痛剂往往 与依赖性相联系，所以发明新的无依赖性的镇痛剂具有重要价值。

土鳖及土鳖干粉在我国传统医学中广泛应用于治疗带状疱疹。发明人根据带状疱 疹伴随激烈疼痛及土鳖干粉的治疗效果，推断土鳖干粉中存在镇痛组分。土鳖及土鳖 干粉在我国传统医学中应用时都是口服给药，土鳖及土鳖干粉经口服给药的一次剂量 在10g左右。这样大的剂量使病人感到不便。依据土鳖及土鳖干粉的蛋白质性质、蛋 白质经口服进入胃可被胃蛋白酶降解为多肽的性质，以及多肽的良好水溶性，发明人 推测土鳖及土鳖干粉的直接水提物和酶解物有可能在不减弱治疗效果的前提下减少 服药量。

发明内容

本发明要解决的技术问题在于依据土鳖及土鳖干粉的蛋白质性质、蛋白质经口服 进入胃可被胃蛋白酶降解为多肽的性质，以及多肽的良好水溶性，研究设计土鳖干粉 的提取物的制备和用途。

本发明提供了一种土鳖干粉提取物的制备方法，该方法包括水提法或酶解法。

1、水提法土鳖干粉提取物的制备方法，该方法包括下列步骤：

(1)土鳖水提多肽粗粉的制备：将土鳖干粉与蒸馏水按3∶100w/v的比例悬浮、50 ℃±3℃恒温搅拌60分钟、过滤、滤液冷冻干燥、得到的水提多肽粗粉W₀4℃保存；

(2)土鳖水提多肽粗粉的分离与纯化：将水提多肽粗粉W₀与蒸馏水按6∶1w/v的 比例溶解、10000转离心10分钟、上清液加载到Sephadex G25层析柱上、以0.007mol/ L乙酸胺缓冲液洗脱，流速0.8mL/min，紫外检测波长280nm、收集的馏份按峰合并、 冷冻干燥、得到W_I、W_II、W_III和W_IV四种水提多肽组分。

(3)得到W_I、W_II、W_III和W_IV四种水提多肽组分制成冻干粉。

2、酶解法土鳖干粉提取物的制备方法，该方法包括下列步骤：

(1)土鳖酶解多肽粗粉的制备：将土鳖干粉与蒸馏水按1∶10w/v的比例悬浮、得 到的悬浮液与模拟胃液2.0gNaCl，3.2g胃蛋白酶，7ml浓HCl，双蒸水定容于1000ml，pH 值为1.2按1∶1的比例混合、46℃±3℃恒温振荡4小时、减压过滤、滤液用固体NaHCO₃调pH7.0、3000转离心5分钟、收集上清液、冷冻干燥，得到的酶解多肽粗品(E₀)4 ℃保存；

(2)建立土鳖酶解多肽粗粉的分离与纯化将酶解多肽粗粉与蒸馏水按5∶1w/v的 比例溶解、10000转离心10分钟、上清液加载到Sephadex G25层析柱上、以0.007mol/ L乙酸胺缓冲液洗脱流速0.8mL/min，紫外检测波长280nm、收集的馏份按峰合并、 冷冻干燥、得到E_I、E_II和E_III三种多肽组分；

(3)得到E_I、E_II和E_III三种多肽组分制成冻干粉。

通过测定分离得到的水解多肽组分W_IV的HPLC指纹图谱和HPLC-ESI-MS指纹 图谱，以及E₀、E_I、E_II和E_III四种酶解多肽组分的HPLC指纹图谱和HPLC-ESI-MS 指纹图谱，确定水解多肽组分W_IV和酶解多肽组分E_I、E_II和E_III多肽的氨基酸序列。

镇痛活性最强的W_IV水提多肽组分测定HPLC-ESI-MS之后，选择适宜的峰测定 ESI-MS，根据互补原理分析图谱(图4)，得到一种序列：