[发明专利]一种介导受体菌对喹诺酮类抗菌药物敏感性下降的质粒

说明书

技术领域

本发明属微生物学领域，涉及一种可介导受体菌对喹诺酮类抗菌药物敏感性下降的质粒，该质粒携带的可介导革兰阴性杆菌对喹诺酮类的耐药基因，及该基因的制备方法和用途。

背景技术

喹诺酮类抗菌药物广泛用于治疗尿路感染、呼吸道感染、腹腔感染等，但随着临床应用的增多，细菌对喹诺酮类药物的耐药性上升迅速。在中国，大肠埃希菌对喹诺酮类的耐药性上升迅速，目前耐药率位居全球之首，大大高于其他国家。据国内细菌耐药性监测资料，1988年喹诺酮类开始在国内应用时，大肠埃希菌对其几乎全部敏感，耐药率仅为0～3％，但数年后(1992-1993年)即猛增至41％～54％，而1999-2004年全国各大城市的报道耐药率均高于50％，部分报道高于70％。具有关统计，目前其他国家大肠埃希菌对喹诺酮类的耐药率显示：西班牙社区感染为12％、医院感染20％，拉丁美洲医院感染13％，西欧医院感染8％，英国及加拿大医院感染3％～3.7％，美国医院及社区感染均约为5％。同时国内其他革兰阴性杆菌对喹诺酮类的耐药性也相当高，2003年上海地区临床分离铜绿假单胞菌、克雷伯菌属、肠杆菌属及不动杆菌属细菌对环丙沙星的耐药率达19％～42％。

研究发现，细菌对喹诺酮类的耐药机制主要为靶位(DNA旋转酶及拓扑异构酶IV)改变及主动外排，两者均为染色体介导。DNA旋转酶由GyrA及GyrB2个亚单位组成，相对应地拓扑异构酶IV由ParC及ParE组成，突变点位多发生于GyrA及ParC的喹诺酮耐药决定区(quinolone-resistance-determiningregion，QRDR)，GyrA的最常见突变位点为83及87，PareC的最常见位点为80及84。与GryA及ParC比较，GyrB及ParE的突变发生率相对较低。至于外排机制，大肠埃希菌的外排作用与AcrAB-TolC、EmrAB及MdfA外排系统有关，同时存在膜蛋白OmpF的减少；铜绿假单胞菌涉及4个外排泵系统MexAB-OprM、MexCD-OprJ、MexEF-OprN及MexXY-OprM。

上述耐药性的形成均由染色体突变所致，但1998年Jacoby实验小组自1株肺炎克雷伯菌临床分离菌中获得1个耐药质粒，将该质粒转移至其他细菌时，细菌对喹诺酮类的最低抑菌浓度上升4～16倍，首次证实了革兰阴性杆菌中存在质粒介导喹诺酮类耐药。随后耐药基因被克隆出来，其长度为657核苷酸，编码218个氨基酸的蛋白。该基因最初命名为qnr，由于之后又发现更多的qnr类似的基因qnrB、qnrS，现命名为qnrA。在体外纯化得QnrA蛋白可以保护DNA旋转酶及拓扑异构酶，使细菌对喹诺酮类药物敏感性降低。后续在福氏志贺菌和肺炎克雷菌中发现qnrS及qnrB，与qnrA的作用类似。这些基因已发现若干同源较高的亚型，按发现的先后在上述基因后加阿拉伯数字进行命名，如：qnrA1、qnrB1，qnrS1等。这些研究发现表明，质粒介导喹诺酮类耐药在各种革兰阴性杆菌临床株中的广泛存在。

发明内容

本发明的目的是为解决临床用药耐药性的问题，尤其是解决喹诺酮类药物耐药性的问题以及为研发新型喹诺酮类抗菌药物，提供一种可介导受体菌对喹诺酮类抗菌药物敏感性下降的质粒。

本发明还提供了该质粒携带的可介导革兰阴性杆菌对喹诺酮类的耐药基因，及该基因的制备方法，

本发明进一步提供检测上述耐药基因的方法。

临床实践显示，目前喹诺酮类药物临床应用的最大问题是细菌耐药性高，影响临床疗效。本发明从喹诺酮类药物耐药性产生的机制着手，寻找可介导细菌耐药的新基因，以进一步控制耐药性的形成及推动新型喹诺酮类抗菌药物的研发。

本发明以临床分离的革兰阴性杆菌株为供体菌，以E.coli J53Az^R(由美国麻省总院David C.Hooper提供，联系方式及菌株特性见Antimicrob.Agents Chemother.2003，47：2242-2248.)为受体菌，通过本领域公知的接合实验，获得可介导受体菌E.coli-J53Az^R对喹诺酮类抗菌药物敏感性下降的质粒。

所述的供体菌为临床分离奇异变形杆菌，编号为06-489，根据布达佩斯条约的规定，于2007年9月26日将该供体菌保存于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC，中国北京)；保藏号：CGMCC2189。

所述的对喹诺酮类抗菌药物敏感性下降的质粒命名为pHS10，该质粒的碱基对数量大小为100-120kb，喹诺酮类药物环丙沙星对含该质粒接合子的最低抑菌浓度(MIC)为0.125μg/ml。