[发明专利]生产大豆异黄酮的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种农业技术领域的方法，具体涉及一种生产大豆异黄酮的方法。

背景技术

大豆异黄酮(soybean isoflavones)是大豆在生长过程中形成的次级代谢产物，是生物黄酮中的一种，也是一种植物雌激素。目前发现的大豆中天然存在的大豆异黄酮为多酚类化合物，主要分布于大豆种子的子叶和胚轴中，种皮中含量极少，80％-90％的异黄酮存在于子叶中，浓度为0.1％-0.3％。胚轴中所含异黄酮种类较多且浓度较高，为1％-2％，但由于胚只占种子总重量的2％，因此尽管浓度很高，所占比例却很少(10％-20％)。

大豆异黄酮是大豆中一类非常重要的非营养成分，它具有抗氧化、抗癌、提高免疫力、防止骨质疏松、类似雌性激素的作用。目前国内外主要采用直接从大豆中提取异黄酮、从大豆加工后的中间产物、废弃物中提取异黄酮，以及用分解与合成的方法生产大豆异黄酮。目前大多数的研究专利是直接从大豆粉、豆粕中提取大豆异黄酮。由于大豆的子叶及胚轴的异黄酮含量较高，尤其是萌发大豆的胚轴中大豆异黄酮含量很高。

经对现有技术的文献检索发现，中国专利申请号02114991.7，发明名称为萃取大豆异黄酮的方法，该专利提出涉及一种通过大豆种子萌动期分离大豆胚轴供萃取大豆异黄酮的方法。但这种方法是将成熟饱满的大豆种子，经冷水浸泡萌动至初始萌芽状态，经脱皮、大豆子叶分瓣、子叶与大豆胚轴分离的方法得到胚芽，只有新鲜的能够萌发的大豆种子才能通过这种方法获得活的，可以生长的大豆胚芽。而且一粒大豆种子，只有一个胚芽，但胚芽在一粒种子中所占的重量比很小，占大豆总重量的2％～2.5％。一粒新鲜的种子经过这种方法去掉胚芽之后，拨掉的子叶必须马上进行加工处理，否则就会很快变质，失去加工价值，造成浪费。因此，尽管胚芽中大豆异黄酮的含量很高，是子叶中的8～10倍，但由于胚芽的获得及产量十分有限，因此采用这种方法生产大豆异黄酮也受到很大的限制。

利用大豆高含异黄酮部位(如下胚轴，胚芽，以及萌动的大豆种子)提取大豆异黄酮，已成为提高大豆异黄酮生产效率的有效途径。但现有方法都是利用大豆植物体本身，取其中含量较高的部位生产和提取大豆异黄酮。

发明内容

本发明的目的在于针对现有技术的不足，提出一种生产大豆异黄酮的方法。本发明不是利用在自然状态下的大豆种子，萌发的大豆种子，以及大豆种子的某一部分用于异黄酮的提取，而是利用发根农杆菌感染大豆幼苗(无菌苗)，使之产生发根，再通过发根的增殖及扩大培养，生产发根，供大豆异黄酮的提取及生产使用，解决了从胚芽中提取大豆异黄酮虽然含量高，但生物量小的限制，因此可以达到高效生产大豆异黄酮的效果。

本发明是通过以下技术方案实现的，本发明包括以下步骤：

第一步，大豆无菌苗的获得：取成熟的大豆种子，用氯气或过饱和漂白粉精片溶液进行大豆种子灭菌，而后将大豆种子种脐向下接种到萌发培养基上，经过培养得到大豆无菌苗，为“第二步”发根农杆菌的侵染提供植物受体材料。

所述萌发培养基为MS培养基，B₅基本培养基，或MS培养基的无机成分加上B₅培养基的有机成分，在温度为24℃-26℃条件下培养7-10天。

第二步，农杆菌侵染：用经过活化的发根农杆菌侵染在“第一步”中得到的大豆无菌苗的不同部位，包括下胚轴，子叶节，子叶，真叶及根等部位。接种方法采用常规的农杆菌侵染方法，以及针刺胚轴，子叶节，子叶及真叶，根等部位的方法，也可以采用下胚轴切段，农杆菌侵染的方法。待被侵染部位长出毛状发根后，切下发根，置于扩大繁殖培养基中生长。

所述扩大繁殖培养基，为MS固体、液体培养基，或B₅液体、固体培养基，培养温度为24℃-26℃。为第三步的大豆异黄酮提取及不同成分的含量测定提供植物材料。

第三步，大豆异黄酮的提取：用乙醇从第二步得到的发根中提取大豆异黄酮。

所述乙醇，其体积浓度为70％-80％。

经紫外分光光度计法检测发根中大豆异黄酮的不同成分及含量，测定发根中大豆异黄酮的含量远远高于相同培养条件下正常大豆根系中异黄酮的含量，是正常生长的对照根的4-10倍。同时发根中异黄酮的含量也高于相同培养条件及田间自然生长条件下大豆植物体任何部位中的异黄酮含量，包括公认异黄酮含量最高的下胚轴部位。因此利用发根农杆菌侵染大豆产生发根，再通过发根的扩大培养，可以达到高效产生大豆异黄酮目的。