[发明专利]抗菌肽融合蛋白基因、其重组载体、其转化体及其表达产物

说明书

技术领域

本发明属于基因工程药物领域，具体涉及抗菌肽citropin 1.18融合蛋白基因、含有该基因的重组载体和转化体以及该基因的表达产物和其用途。

背景资料

新生血管生成，是指从既存的成熟血管形成新的毛细血管网络的过程，这个过程对于脊椎动物的生理发育和损伤组织的修复是必需的，同时，许多疾病的病理过程都涉及到新生血管生成，包括肿瘤生长、心血管疾病、糖尿病性视网膜病变、银屑病和风湿性关节炎等疾病(Ortega N，Werb Z..J Cell Sci，2002，115(Pt 22)：4201-4214；Sottile J.Biochim Biophys Acta，2004，1654(1)：13-22；HamanoY et al Biophys Res Commun，2005，333(2)：292-298)。

肿瘤是一种环境因素与遗传因素互相作用而产生的一类疾病，是细胞中多种基因突变累积的结果。目前，肿瘤化疗技术已经取得了相当的进步，从而使肿瘤患者生存时间明显延长，特别是对白血病、恶性淋巴瘤等治疗有了突破，但对危害人类生命健康最严重的、占恶性肿瘤90％以上的实体瘤的治疗未能达到满意的效果。药学家和肿瘤学家越来越深刻地认识到：要提高肿瘤治疗的效果，必须从肿瘤发生发展的机制着手，才能取得新的突破性进展。1971年，Folkman(N Engl J Med，1971，285(21)：1182-1186)提出“肿瘤的生长和转移都依赖于新生血管的生成”的观点。肿瘤的生长取决于肿瘤细胞和肿瘤血管内皮细胞的数量，两者相互依存，任何一种细胞群的增减都会导致另一细胞群的相应增减。

循此思路的研究，已有多种抑制新生血管生成的药物，如肿瘤抑素(tumstatin)、血管生成抑素(angiostatin)、内皮抑素(endostatin)、kringle5、抗-凝血酶III用于抗肿瘤的研究，有的已经进入临床研究阶段，它们通过作用于遗传上稳定，不易产生药物抗性的内皮细胞来抑制肿瘤的生长(R.Kalluri.Cold Spring Harb Symp Quant Biol，2002，67：255-266；Nyberg P et al.Cancer Res，2005，65(10)：3967-3979；Maeshima Y et al.J Biol Chem，2000，275(28)：21340-21348)。肿瘤抑素属于胶原蛋白IVα3链的一部分。每一个α3链单体由一个半胱氨酸丰富的N端7S区，中间的三螺旋区和C端球形非胶原区(NC1)组成。三条α3链通过NC1区相互作用、三螺旋区的缠绕、7S区的共价结合构成了三聚体结构。两个三聚体通过NC1区头与头相连。四个三聚体通过7S区共价连接构成胶原蛋白IV的网状结构。肿瘤抑素由MMP-9蛋白水解酶从胶原蛋白IVα3链水解而来，分子量为28kD，由244个氨基酸组成，其中12个氨基酸来源于三螺旋区，232个氨基酸位于NC1区；有两个活性区：一个具有抗肿瘤细胞增殖作用的靠近C端的185～203氨基酸之间，另一个具抗肿瘤血管生成作用的接近N端的54～132氨基酸之间(tum-5)。其抗肿瘤血管生成作用与二硫键无关，在去除二硫键或将二硫键烷基化时，tum-5的活性不受影响。利用这种特性将tum-5分成八个肽，人工合成重叠序列来研究其活性区，研究表明T7肽(74～98)具有与tum-5相同的抗血管生成作用，因此肿瘤抑素抗血管作用活性区可能位于中间的25个氨基酸。同时T7肽还可改造成与其具同等作用的易溶的T8肽(Maeshima Y et al.J Biol Chem，2001，276(34)：31959-31968)。

抗菌肽citropin1.18来源于蓝岭树蛙(Litoria citropa)的皮腺分泌物，是16个氨基酸残基组成的活性小分子肽，可通过其C末端带正电荷的极性氨基酸，与肿瘤细胞膜表层带负电荷的磷脂(PS)产生静电引力作用，使多肽聚集于肿瘤细胞膜表面。聚集的多肽呈现α-螺旋结构，非极性的一侧疏水氨基酸借疏水作用伸入细胞膜内层，造成膜内分子位移、质膜穿孔，从而杀伤肿瘤细胞。

目前研究的抗肿瘤药物，基本上都是从抗血管活性、或直接杀伤肿瘤细胞等单方面着手，一定程度上作用手段单一，容易产生耐药性。有些如肿瘤坏死因子α(TNFα)，大量的动物试验表明具有强大的抗肿瘤活性，但临床效果不理想，原因是毒副作用太大。

若可以从同时直接杀伤肿瘤细胞和抑制新生血管两方面着手，这为抗肿瘤以及和所有与新血管生成相关的疾病治疗提供了一条新思路。