[发明专利]利用酵母单杂交体系获取抗冻相关转录因子基因

说明书

技术领域

本发明属于作物遗传育种领域，具体地说利用酵母单杂交体系从水稻基因表达文库中筛选与水稻抗冻相关的基因，利用农杆菌将筛选基因转化到水稻中，使之能在水稻中高效表达，提高水稻的抗冻能力。

背景技术

低温是影响植物生长、发育及其地理分布的重要环境限制因素之一。大多数热带和亚热带植物由于缺乏对低温的适应能力，当环境温度低于10℃时就会受到伤害，严重影响植物的正常生长、发育甚至造成死亡。分布于温带地区的植物，在温暖季节对冰冻的抗性相当弱。水稻是主要粮食作物之一，属喜温作物。目前水稻从南纬34°的南美洲大西洋沿岸至北纬53°27′的黑龙江漠河、从平原到海拔2700m范围内广泛栽培，而水稻生长所需的适宜温度为15～18℃至30～33℃，因此低温冷害发生比较普遍。我国南方早春寒潮入侵，气温骤然下降，容易造成水稻幼苗严重的冻害，大部分水稻作物品种的幼苗不能适应这种变化无常的不良气候环境，从而导致水稻幼苗的伤害和死亡。我国每年因低温冷害使稻谷减产30～50亿公斤。为了培育耐寒能力较强的品种应用于生产，分离和鉴定对抗冻性提高起着关键作用的低温反应基因显得十分重要。

植物在低温环境生长一段时间后，能够增强抗冻能力，从而耐受随即发生的冰冻温度，这个适应过程称为低温驯化。低温驯化是一个十分复杂的过程。近二十年来，世界各地的科研工作者围绕在低温驯化过程中植物发生的生理生化和分子水平的各种变化进行了大量的研究。最新的研究表明至少有300个低温反应基因参与了低温驯化进程，基因的蛋白产物可分为两大类：一类是直接保护细胞免受胁迫伤害的功能蛋白，另一类是调控基因表达的转录因子蛋白。

直接参与冰冻保护的功能蛋白包括参与渗透调节物合成的关键酶、参与活性氧清除的各种抗氧化酶以及冰冻保护蛋白。大量实验证明通过转化脯氨酸合成酶基因可增强转基因植物的抗冻性。而植物受到低温和干旱胁迫时，甜菜碱醛脱氢酶(BADH)活性增强，BADH基因的表达量增加，从而使甜菜碱大量积累(Hunghes 1996，试验植物学报)。低温胁迫下，参与植物抗氧化的酶含量和活性均发生变化。对玉米研究表明低温胁迫下玉米超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)等活性改变；糖、抗坏血酸、谷胱甘肽含量也发生变化。转MnSOD基因玉米，超氧化物歧化酶含量和活性均增强，因而抗寒力明显增强。经低温胁迫适应的玉米其抗氧化系统活力增强，耐低温胁迫的能力明显提高，说明低温对这些酶有一定诱导作用，而低温诱导产生的酶一定程度缓解了植物氧化性伤害(Breusegem 1999，试验植物学报)。对甘蓝研究发现1种约10kD的冷凝蛋白，该冷凝蛋白是1种非特异依赖于Ca2+和Mn2+脂类转移蛋白，可在冻融过程中保护类囊体活性，该蛋白与Ca2+和Mn2+的螯合能力同植物抗冷能力密切相关(Huang 1995，低温生物学)。Mohapatra等在苜蓿中已分离到多种冷驯化特异的cDNA，对脱落酸诱导(ABA)、脱水处理诱导的转录累积与冰冻耐受性明显正相关(植物生理学报1989)。冷驯化能诱导多种COR蛋白基因表达，如拟南芥在冷驯化过程中能产生COR6.6，COR15a，COR78以及与LEA(Late embryogenesisabundant)蛋白同源的COR47。Thomashow研究发现拟南芥受低温、干旱或ABA处理时能诱导表达15kD的COR15a多肽，此多肽在叶绿体的基质内转变为94kD的成熟多肽COR15am。使COR15am多肽在转基因拟南芥中大量表达后，叶绿体和原生质体的抗冻性提高1℃-2℃，并增强原生质膜稳定性，减轻寒冻损害(植物分子生物学报1994)。Imai等将西红柿Le25基因转入酵母中大量表达后，显著提高酵母细胞耐寒性(试验植物学报1995)。