[发明专利]基于dI修饰引物和内切核酸酶V的等温PCR核酸扩增方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种新的核酸扩增方法，尤其涉及一种基于dI修饰引物和内切核酸酶V的等温PCR核酸扩增方法，可以用于等温扩增目标核酸，属于基因工程技术领域。

背景技术

聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction，PCR)是一种有着众多应用的常规分子生物学技术。常规PCR主要由三步反应组成：1)目标核酸模板分子的热变性，2)自由引物与变性的目标核酸模板分子间的杂交退火，3)热稳定性DNA聚合酶催化结合在目标核酸模板分子上的引物的DNA合成反应。常规PCR的三步反应重复循环进行，实现目标核酸的指数倍数扩增。常规PCR需要昂贵的热循环仪。等温PCR是一种新型核酸扩增技术，不需要热循环仪。在等温PCR中，引物与目标核酸模板分子经变性退火，形成互补配对的引物-模板复合物，在恒定温度(一般是DNA聚合酶的最适反应温度)下由DNA聚合酶催化DNA合成反应的持续进行。等温PCR需要在DNA合成过程中持续地自动生成引物-模板复合物(DNA合成反应的有效底物)，以使DNA合成反应能够持续进行。由于等温PCR不依赖于热循环仪，可以在水浴锅中进行反应，操作空间大，可以方便的扩大反应体积与通量。

目前常用的等温PCR主要有两种：基于滚环复制的等温PCR和基于loop结构引物的等温PCR[Nucleic Acids Res.，2006，34：e98；Genome Res.，2001，11：1095-1099；Nucleic Acids Res.，2000，28：e63.]。其中基于滚环复制的等温PCR根据DNA聚合酶的差异，分为phi 29 DNA聚合酶催化的等温PCR和T7 DNA聚合酶催化的等温PCR。在phi 29 DNA聚合酶催化的等温PCR中，正向引物结合于环状单链目标核酸模板分子，在37度下phi 29 DNA聚合酶以滚环复制的形式置换合成长的单链DNA，反向引物结合于滚环复制合成的长的单链DNA，合成长度各异的双链DNA。与phi 29 DNA聚合酶类似，T7 DNA聚合酶也以环状DNA为模板，利用正向引物与反向引物，在37度下合成长度各异的众多双链DNA。基于loop结构引物的等温PCR以线性DNA为模板，利用4条引物，最终合成各种长度的双链DNA。

现有等温PCR技术的缺陷主要有：1)扩增产物为长度各异的双链DNA混合物，需要用限制性内切核酸酶消化来形成长度均一的DNA片段；2)phi 29 DNA聚合酶与T7 DNA聚合酶催化的等温PCR只能扩增长度比较短的环状目标核酸模板分子，且常常产生非特异性扩增条带；3)虽然基于loop结构引物的等温PCR可以扩增高度复杂的线状DNA分子，但其扩增片段的长度有限，一般低于250 bp；4)基于loop结构引物的等温PCR需要两对引物，扩增反应操作复杂，任何一对引物引发的DNA合成反应的失败均会造成目标核酸扩增的失败。

发明内容

本发明的目的在于针对现有等温PCR技术的不足，提供一种基于dI修饰引物和内切核酸酶V的等温PCR核酸扩增方法，该等温PCR操作简便，扩增效率、扩增片段长度和特异性大大提高，可用于等温扩增长度均一的目标核酸片段。

为实现这样的目的，本发明通过内切核酸酶V与dI修饰引物实现引物-模板复合物的再生。在本发明中，用于扩增目标核酸的正向引物与反向引物具有如下特征：整条引物与目标核酸模板分子完全配对，5’端第10-30位含有1-5个dI核苷酸，dI核苷酸下游具有10-30个核苷酸。等温PCR反应组分包括dI修饰的正向引物与反向引物、目标核酸模板分子、dATP、dTTP、dCTP、dGTP共4种脱氧核糖核苷三磷酸、DNA聚合酶、内切核酸酶V、单链DNA结合蛋白和解螺旋酶。等温PCR混合物经过最初的热变性、杂交退火后，在恒定温度下进行PCR。在扩增过程中由内切核酸酶V实现引物-模板复合物的循环再生，引发DNA合成反应；单链DNA结合蛋白与解螺旋酶可以提高等温PCR的目标核酸扩增效率。

本发明方法的具体步骤如下：

1、设计合成用于扩增目标核酸的正向引物与反向引物，正向引物与反向引物的序列特征是：整条引物与目标核酸模板分子完全配对，5’端第10-30位含有1-5个dI核苷酸，dI核苷酸下游具有10-30个核苷酸；