[发明专利]一种鸡白细胞介素1β基因及其真核表达质粒构建及免疫效应

说明书

[技术领域]本发明涉及动物医药生物工程领域，是一种鸡白细胞介素1β基因及其真核表达质粒与应用。

[背景技术]细胞因子作为机体内细胞之间相互作用的主要介质，在机体的免疫应答、炎症反应、造血功能、胚胎发育及机体的生长发育等各个方面都起重要作用。20世纪80年代以来，随着细胞因子的研究进展，人们逐渐认识到细胞因子的免疫增强作用。细胞因子对免疫细胞的分化和增殖、抗原的识别和提呈、抗体的产生和调节、免疫细胞之间的联络等一系列从识别到效应的免疫应答过程都有极其重要的作用。可以说细胞因子对于免疫系统就如激素对于内分泌系统，神经递质对神经系统一样重要。细胞因子控制着疫苗免疫和病原微生物感染机体后免疫应答的类型和方向，其对免疫应答的调节方式最为接近机体正常的调节机理，细胞因子作为疫苗增强剂具有其他佐剂无法比拟的优点。

白细胞介素1(IL-1)是一种主要由单核细胞、巨噬细胞合成分泌的蛋白多肽，是细胞因子的一种。IL-1有两个分子亚型(IL-1α、IL-1β)，这两个亚型之间氨基酸序列有很大差别，但他们识别同一个受体功能基本相同。哺乳动物IL-1由β和β两条链组成，具有广谱的免疫和非免疫活性。1982年Hayari Y第一次证实了鸡IL-1(ChIL-1)的存在，用脂多糖刺激鸡的脾细胞，在其细胞上清中检测到IL-1样生物活性物质，鸡IL-1样活性最初发现于受刺激的脾细胞条件培养基中。Klasking等将其部分纯化后发现，鸡IL-1对鼠胸腺细胞具有微弱的刺激活。也能微弱地诱导对鼠L-M细胞的杀伤活性。

1998年，Weining等利用LPS刺激HD-11细胞，构建cDNA文库，对所得到的克隆进行功能表达，成功地克隆了鸡的编码ChIL-1β(Chicken IL-1β)cDNA。ChIL-1βcDNA最初的翻译产物含267个氨基酸，与人IL-1β的氨基酸同源性为25％。类似哺乳动物的IL-1β，也缺少信号肽，可能是先合成无活性的前体分子，然后剪切成有活性的分子。其在大肠杆菌中的表达产物接种鸡，可明显诱导血清皮质醇(corticosterone.)一过性的增加。另外，Byme等报道，鸡IL-1β在抗球虫感染的免疫反应中具有重要作用。

Brezinschek等报道鸡IL-1分子量在16-21.5kDa不等，但也有人报道其分子量为5kDa，目前国内关于IL-1β基因的研究比较少，关于其免疫佐剂效应的研究更少。2003年张永霞等^[52]克隆IL-1β与pUC19载体连接，用地高辛随机引物法标记IL-1βcDNA制备探针，原位杂交检测禽脑脊髓炎病鸡与正常鸡脑组织中IL-1βmRNA表达情况，结果表明脑炎病鸡脑中IL-1βmRNA表达水平高于正常鸡。2004年邵卫星等，卢建红等克隆了IL-1β基因，以鸡痘病毒(FPV)为活载体，构建了表达ChIL-1β的重组鸡痘病毒rFPV-IL-1β。应用XTT/PMS方法检测rFPV-IL-1β感染的成纤维细胞72h后表达ChIL-1β的生物活性，效价为1.0×10⁵U/mI，证明FPV能有效地表达ChIL-1β。2006年邵卫星等在新城疫La Sota疫苗免疫不全的情况下，重组鸡痘病毒(rFPV)表达的IL-1β、IL-2和髓细胞生长因子(MGF)是否具有免疫增强作用。10日龄SPF鸡随机分成8组(I～VIII)，每组18只，每只接种1个半数保护剂量(PD50)的LaSota疫苗，同时免疫不同剂量的表达鸡IL-1β、IL-2或cMGF的rFPV(rFPV-IL-1β、IL-2、cMGF)。结果表明，rFPV表达的IL-1β、IL-2或cMGF可以消除鸡痘病毒在免疫早期对雏鸡体重增长的影响；一定剂量的IL-1β和IL-2可使鸡脾脏中CD4+T细胞和CD8+T细胞的总体水平提高；免疫21d后用新城疫的F48E8强毒经肌肉攻毒。一定剂量的IL-1β和IL-2能提高La Sota疫苗的免疫保护率。本研究表明rFPV表达的IL-1β和IL-2在一定的剂量下可以增强La Sota疫苗的免疫效果，具有免疫增强作用。与其他细胞因子相比较，IL-1β在细胞因子网络中属于参与免疫应答早期阶段的细胞因子，且有研究表明，IL-1β可能是细胞因子网络功能形成的中心，促进胸腺细胞、T细胞的活化、增殖和分化，促进多种细胞因子(如IL-2、IFN-γ等)的分泌，在抗细胞内病原体的感染中起着关键的作用，因此IL-1β是具有较好应用前景的免疫佐剂。