[发明专利]人L型补体凝集素纤维胶凝蛋白的表达载体及构建和应用

说明书

技术领域

本发明属微生物感染免疫。在国内外首次涉及利用分子生物学技术克隆并制备一种能在体内增强宿主抗胞内菌感染，如伤寒沙门氏菌鼠伤寒杆菌(Salmonella typhimurium)，并刺激γ-干扰素产生的新型的人L型补体凝集素纤维胶凝蛋白(L-ficolin)cDNA的真核质粒表达载体，其可作为一种新型人体自身的免疫制剂，能增强固有免疫能力。

背景技术

补体系统是机体固有免疫的重要组成成分。目前所知补体系统可通过三种途径激活：经典激活途径，替代激活途径，凝集素激活途径即MBL/ficolin激活途径。在机体抗感染的过程中，人甘露糖凝集素(human mannose-binding lectin，MBL)和补体凝集素纤维胶凝蛋白(ficolin)蛋白参与了对病原微生物的识别，它们可以识别病原微生物表面保守的病原相关分子模式(pathogen-associated molecular pattern，PAMPs)，并进而与MBL相关丝氨酸蛋白酶(MBL-associated serine proteases，MASPs)结合而启动补体凝集素激活途径(Fujita，T.，M.Matsushita，and Y.Endo.2004.The lectin-complement pathway-its role in innateimmunity and evolution.Immunol.Rev.198：185-202)。

目前，已发现了三种类型的人类ficolin蛋白分子，分别是人L-ficolin(又称L-ficolin/P35或FCN2)，M-ficolin(又称FCN1)，以及H-ficolin/Hakata抗原(又称FCN3)。这三种人类ficolin蛋白分子均可识别病原微生物的PAMPs，激活补体发挥生物学效应。目前所知，ficolin蛋白分子可以识别细菌和真菌，它们识别的配体类型包括N-乙酰葡糖胺(GlcNAc)、脂多糖(lipopolysaccharide)、脂膜酸(lipoteichoic acid)。

ficolin蛋白分子含有两个结构区域，它们分别是纤维蛋白原样区和胶原样区。在补体的凝集素激活途径中，ficolin蛋白分子通过纤维蛋白原样区识别病原微生物并通过胶原样区结合MASPs蛋白。

L-ficolin蛋白分子是由分子量为35-kDa的亚单位构成的多聚蛋白分子，其结构与MBL分子类似，首先3个35-kDa的亚单位构成三聚体的结构，然后4个3聚体彼此连接构成一个完整的L-ficolin蛋白分子。在人体内，L-ficolin蛋白分子可与三种类型的MASPs结合即MASP-1，MASP-2和MASP-3；此外L-ficolin蛋白分子还可与小分子MBL相关丝氨酸蛋白酶(small MBL-associated protein，sMAP)结合。L-ficolin蛋白分子与MASPs或sMAP的结合启动补体凝集素途径或者介导了吞噬细胞的调理吞噬作用。L-ficolin蛋白分子对1，3-β-D葡聚糖，N-乙酰葡糖胺以及多种乙酰化的分子均有凝集素样的活性；但L-ficolin蛋白分子与MBL分子不同，它不结合甘露糖。近来的研究表明，L-ficolin蛋白分子可在体外特异性结合临床常见的一些重要的病原菌，比如说鼠伤寒杆菌、肺炎链球菌以及金黄色葡萄球菌。

但是目前L-ficolin蛋白在体内功能还不清楚。在国内外L-ficolin能否在体内抵抗胞内菌感染，并刺激γ-干扰素产生还未见报道。在国内L-ficolin的克隆和表达载体的构建也未见报道。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是：提供一种能在体内增强宿主抗胞内菌感染(如鼠伤寒杆菌感染)并刺激γ-干扰素产生的新型的人L型补体凝集素纤维胶凝蛋白L-ficolin的真核质粒表达载体的免疫制剂，以便制备L-ficolin蛋白分子，为阐明机体固有免疫系统在抗感染中发挥的作用提供帮助，为临床感染性疾病的治疗(尤其是沙门氏菌感染的治疗)提供新的解决途径，并提供一种新型人的免疫制剂，增强固有免疫能力。

本发明解决其技术问题采用以下的技术方案：

本发明提供的人L型补体凝集素纤维胶凝蛋白的表达载体，具有SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列，该序列含有人L型补体凝集素纤维胶凝蛋白分子的939个碱基。

本发明提供的人L型补体凝集素纤维胶凝蛋白的表达载体，其构建的步骤包括：

(1)真核质粒表达载体的构建：