[发明专利]一种检测多倍体植物基因单核苷酸点突变的方法

说明书

                            技术领域

本发明涉及检测多倍体植物在自然条件下所产生的基因内单核苷酸点突变之领域，更具体涉及一种检测具多基因系统(multigene system)的多倍体植物基因核苷酸点突变的方法。在开发DNA标记时，对于能否迅速检测出DNA变异是很重要的。但以往采用的多为DNA测序法，这不仅需要大量劳力，而且成本也很高。本发明可迅速检测大量的SNP(Single Nucleotide Polymorphism)，还可以应用于具多基因系统的多倍体品种的识别。

                            背景技术

目前国内外有一些检测植物基因单核苷酸点突变的方法，例如：PCR-单链构象多态性分析法(PCR-SSCP)、PCR-变性梯度凝胶电泳法(PCR-DGGE)、PCR-扩增特异的等位基因分析法(PCR-PASA)等。

PCR-SSCP分析技术根据形成不同构象的等长DNA单链在中性聚丙烯酰胺凝胶中的电泳迁移率变化来检测基因变异。当DNA单链自发形成二级结构时，其构象又取决于DNA分子的一级结构。通过放射性核素标记自显影或者银染，根据聚丙烯酰胺凝胶电泳中不同构象影响DNA片段的迁移率，来区分正常基因与突变基因。PCR-SSCP技术的缺点：检测存在假阳性，分析片段的大小受限，强烈依赖实验条件之选择，可能会漏检突变。而本发明所是用双色红外萤光检测技术来检测CEL 1酶切产物，能够有效排除假阳性条带。PCR-DGGE：DNA分子的稳定性主要依靠配对碱基间的氢键维系，A-T间有2个氢键，G-C间有3个氢键。当温度升高到一定程度时，氢键断裂，两条单链分开，习惯上称这一温度范围的中点为解链温度(Tm)。不同的DNA分子由于碱基组成不同而有各自不同的Tm，当一段DNA序列中发生点突变时其Tm也将随之发生变化。PCR-DGGE技术正是利用了这一原理，在设计引物时使扩增的目的片段两端具有不同的Tm值，一端较高，另一端相对较低。同时PCR产物分离所用的聚丙烯酰胺凝胶上事先加入变性剂，并形成由低到高的浓度梯度。当PCR产物进行电泳时，不同的DNA片段在特定的浓度位置发生变性，由双链解离成单链，导致片段的迁移率大幅度下降。这样不同的片段变性时间不同，它们在凝胶中位置也就不同，据此就可以区别正常片段与异常片段。PCR-PASA的原理是根据DNA聚合酶，只有在寡聚核苷酸引物3′末端碱基与模板相应碱基完全相配时，才能催化形成磷酸二酯键，使引物延伸。如果引物末端3′碱基位对应的模板位碱基发生点突变，则PCR反应将无法进行。这样，通过设计不同长度的引物，以改变引物3′端碱基的位置，根据PCR反应发生情况，得知对应模板位碱基是否发生了点突变。

以上方法均存在有成本较高，费时，效率不及EcoTILLING法和本发明的SuperEcoTILLING法。

EcoTILLING法和本发明的SuperEcoTILLING法都具有成本低，效率高的特点，但如图1和图2所示，一般的EcoTILLING法需从野生型(wild type)植物和变异型(mutant type)植物中分别提取总DNA，然后将两种DNA按1∶1进行混合；而本发明的SuperEcoTILLING法不需将来自不同植株的总DNA进行混合。

                            发明内容

本发明的目的在于提供一种检测多倍体植物基因单核苷酸点突变的方法。该方法简便，它主要用于具有多基因系统的多倍体植物，其优点是只需设计对多基因系统内的某两个目标基因具有特异性的一对(两条)引物进行PCR扩增。其效果很好，方法易行，实验操作方便，具有百分之百的可重复性。

为了达到上述目的，本发明采用的技术方案是：

TILLING(Targeting Induced Local Lesions IN Genomes，定向诱导基因组局部突变)法是一种全新的反向遗传学(reverse genetics)方法。它将诱发产生高频率点突变的化学诱变方法与PCR筛选技术和Li-Cor公司生产的4300DNA遗传分析系统的双色红外萤光高通量检测技术有效结合，快速有效地从化学诱变剂(EMS)诱变产生的突变群体中鉴定出点突变，这一全新的，高通量，低成本的反向遗传学研究方法大大地方便了植物基因组学的研究。另外，以自然条件下产生的遗传变异个体为研究材料的则称为EcoTILLING。