[发明专利]携带结核分支杆菌Ag85B的减毒伤寒杆菌载体疫苗

说明书

技术领域

本发明属于分子微生物学，以及分子免疫和感染免疫领域。特别是利用分子生物学技术分子克隆设计和制备一种携带结核分支杆菌Ag85B的减毒伤寒杆菌载体疫苗。

背景技术

结核病(Tuberculosis，TB)是一种严重危害人类健康的传染病，由结核杆菌(Mycobacteroim tuberculosis，MTB)感染引起。据WHO估计，全球人口的1/3感染过结核分枝杆菌，每年新发病例数达800-1000万例，其中死亡约300万例，死于结核病的人数是其它传染病死亡人数的总和^[1]。中国是除印度外的世界第二大结核病重灾区，我国目前结核病例每年递增已逾百万，年死亡人数达25万，约为其它传染病总死亡人数的2倍。目前由于对多种药物耐受的结核菌株正在不断增多，以及结核分枝杆菌与艾滋病毒的联合感染，使带菌者发展成为结核病的危险性增加等因素，世界卫生组织已经把结核病与艾滋病、疟疾一起列为人类的最主要杀手^[2，3]。

卡介苗(BCG)用于预防结核病已有60多年的历史，现行的BC6免疫保护效果不稳定(0-80％)^[4]，它虽可较好地预防幼儿粟粒性结核和结核性脑膜炎，但却不能有效地预防成人肺结核，而且也不能应用于结核病的高危人群——艾滋病毒感染者^[5]。寻找新型有效的预防、治疗性疫苗已成为当今抗结核疫苗研究领域急待解决的问题。

鉴于当前TB流行的严重程度和BCG预防TB的缺陷，国内外学者已转向减毒活疫苗、MTB亚单位疫苗与基因工程重组活疫苗及DNA疫苗等的开发研究，以用于TB的防治^[6，7]。

在疫苗研究的发展中，减毒活疫苗的抗原成分多，免疫原性强，既能提供外源性抗原又能提供内源性抗原，从而诱导机体产生全面的免疫应答，具有良好的免疫保护作用，能诱发自身免疫性。伤寒杆菌是细胞内侵袭性致病菌，通过肠道或上呼吸道粘膜感染，侵入粘膜相关淋巴组织内，被抗原递呈细胞，主要是树突状细胞、巨噬细胞摄取，并在其中增殖，由于其感染的靶向性，减毒的伤寒杆菌可作为DNA疫苗的载体，含有病原体抗原基因的真核表达质粒的减毒伤寒杆菌将表达病原体的抗原蛋白，从而诱发机体对该蛋白的全面免疫应答(包括细胞免疫，体液免疫和粘膜免疫)，达到对感染性疾病的预防作用。

机体抗御结核杆菌的感染主要依靠细胞免疫^[8]。能诱发保护性细胞免疫应答结核杆菌蛋白大多存在于该菌对数生长早期的培养滤液中^[9]。结核杆菌的DNA疫苗中迄今已有23种结核杆菌编码蛋白的基因被用作研究，其中一些可在动物体内诱发保护性免疫，包括特异性抗体的产生，Th1型和CD8+CTL介导的细胞免疫反应，并能抵抗毒株的攻击^[10-12]。但至今还没有任何一种的结核病DNA疫苗的免疫保护效果超过BCG^[13]。

Ag85B又称MPB59，是结核杆菌主要分泌蛋白Ag85复合体(包括Ag85A，Ag85B和Ag85C组分)之一。目前，已知该复合体属于分枝菌酸转移酶，在结核杆菌细胞壁合成的晚期起关键作用。在结核杆菌众多的分泌蛋白中，Ag85B含量最大。Ag85B具有多个T细胞表位，能诱导机体产生保护性细胞免疫。它可诱导实验动物产生Th1型免疫应答，还可诱导PPD阳性健康人群外周血单个核细胞分泌高水平的IFN-γ^[14，15]。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是：提供一种新型的携带结核分支杆菌Ag85B的减毒伤寒杆菌载体疫苗，以便为当今抗结核疫苗研究领域急待寻找新型有效的预防、治疗性疫苗作出有力的贡献。

本发明解决其技术问题采用以下的技术方案：

本发明提供的携带结核分支杆菌Ag85B的减毒伤寒杆菌载体疫苗，由包括以下步骤的方法制得：

(1)原核重组表达质粒pGEX-Ag85B的制备：

利用PCR方法对目的基因即Ag85B的BX842578基因序列中的121-975位进行扩增，再提取原核表达质粒pGEX-KG，并经酶切回收及鉴定，获得pGEX-Ag85B；

(2)真核重组表达质粒pVAX1-Ag85B的构建：