[发明专利]高效表达SARS冠状病毒S蛋白的重组杆状病毒及构建

权利要求书

1.一种高效表达SARS冠状病毒S蛋白的重组杆状病毒，其特征是CCTCC NO：V200703。

2.一种高效表达SARS冠状病毒S蛋白的重组杆状病毒的构建方法，其特征是基于杆状病毒Bac-to-Bac表达系统，利用改造的带有病毒AcMNPV自身的组织蛋白酶信号肽基因的转移载体pFastBacSHTa，将SΔ即由SARS-CoV WH20株S蛋白基因中去除了其1～13 aa信号肽和跨膜序列后的近全长S片段序列31～3588bp，克隆到pFastBacSHTa的多克隆位点上，使SΔ基因序列与6个组氨酸标签对框融合，从而获得新的转移载体质粒pFastBacSHTa-SΔ，再利用该质粒上的同源臂将其转座到双缺失的穿梭载体Ac-bacΔCC上，获得重组穿梭载体Ac-bacΔCC-SΔ，然后转染昆虫细胞，即可获得重组病毒AcMNPV-ΔCC-SΔ，其为CCTCC NO：V200703。

3.根据权利要求2所述的重组杆状病毒的构建方法，其特征在于：SARS-CoV WH20株S蛋白序列具有SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列。

4.根据权利要求2所述的重组杆状病毒的构建方法，其特征是转移载体pFastBacSHTa由以下步骤的方法获得：

(1)先用PCR法从含组织蛋白酶信号肽基因的野生型AcMNPV的bacmid中扩增出Ca SP基因序列，克隆到pGEM-T Easy上，获得含Ca SP基因质粒pGEM-T Easy-Ca SP，并进行测序验证；

(2)在商品化的转移载体质粒pFastBacHTa上进行改造，应用AflII和NheI双酶切pGEM-T Easy-Ca SP，获得带双酶切粘端的Ca SP，把其克隆到用同样的两个酶消化的质粒pFastBacHTa上，即在6个组氨酸标签前对框插入，获得新的转移载体质粒pFastBacSHTa。

5.根据权利要求2所述的重组杆状病毒的构建方法，其特征是转移载体质粒pFastBacSHTa-SΔ由以下步骤的方法获得：

(1)以SARS病毒WH20株的mRNA为模板，通过一步RT-PCR得到S基因的1～1979bp和1843-3588bp两个片段，由于两段间有137bp的重叠，再通过重叠拼接聚合酶链式反应扩增出S基因的31～3588bp片段，命名为SΔ，将SΔ克隆到T载体即pGEM-TEasy上，获得含SΔ基因的质粒pGEM-T Easy-SΔ，并进行测序验证；

(2)应用SpeI单酶切pGEM-T Easy-SΔ，之后用Klenow酶补平，获得双平端的SΔ，把其克隆到用XhoI酶切消化并补平的质粒pFastBacSHTa的多克隆位点MCS上，即与6×His标签对框融合，获得转移载体质粒pFastBacSHTa-SΔ。

6.根据权利要求2所述的重组杆状病毒的构建方法，其特征是重组穿梭载体Ac-bacΔCC-SΔ由以下步骤的方法获得：

(1)在AcMNPV野生型穿梭载体上，利用分子生物技术在已删除了几丁质酶和组织蛋白酶基因编码区的位点处，插入氯霉素标记基因或绿色荧光蛋白GFP标记基因，获得双缺失的穿梭载体Ac-bacΔCC；

(2)将pFastBacSHTa-SΔ转化到含Ac-bacΔCC的大肠杆菌DH10B细胞中，通过位点特异性转座作用，经过PCR检测和基因组酶切检测获得重组穿梭载体Ac-bacΔCC-SΔ。

7.根据权利要求6所述的重组杆状病毒的构建方法，其特征是将重组穿梭载体Ac-bacΔCC-SΔ转染昆虫细胞sf9、sf21，收集病毒上清经过纯化，即可得到纯的CCTCC NO：V200703。

8.一种权利要求2所述高效表达SARS冠状病毒S蛋白的重组杆状病毒的构建方法，其在进行下一步基于S蛋白的免疫诊断、疫苗研发或疾病治疗及研究方面中的用途。

9.一种权利要求2所述高效表达SARS冠状病毒S蛋白的重组杆状病毒的构建方法，其在对S基因的表达产物进行类似于哺乳动物体内的翻译后加工和糖基化修饰作用，使S蛋白的表达产物在结构及功能上更接近天然蛋白中的用途。

10.一种权利要求2所述高效表达SARS冠状病毒S蛋白的重组杆状病毒的构建方法，其在用于难以表达的外源蛋白中的用途，该外源蛋白包括膜结构蛋白，以及高分子量、修饰加工复杂的蛋白。