[发明专利]一种高活力葡萄糖氧化酶的编码基因及制备方法和应用

说明书

技术领域

本发明涉及分子酶学与生物技术，具体涉及一种高活力葡萄糖氧化酶的编码基因，同时涉及该突变株编码基因的制备方法。该突变基因编码的高酶活葡萄糖氧化酶突变株蛋白，可以广泛应用于食品、医药及生物等领域。

背景技术

葡萄糖氧化酶是生物领域中最主要的工具酶之一。目前应用中使用的葡萄糖氧化酶的生产一般都采用黑曲霉和青霉属菌株作生产菌，进行深层通风培养的方法制取。我国和美国常以点青霉和黄色青霉为生产菌种，日本则筛选出尼崎青霉作为常用菌种。

自1967年Updike和Hicks将GOD固定在Clark氧电极表面，将其应用于血糖测定以来，GOD被广泛应用于食品、饲料、医药等许多相关领域。

在食品工业中，由于氧的存在，引起许多不利于产品质量的化学反应，并为许多微生物生长创造了条件。目前，许多国家已将GOD作为人工的安全抗氧剂而广泛应用于各种食品和食品加工工艺中。虽然用途多样，GOD的作用主要在于除葡萄糖、除氧、形成过氧化氢、形成葡萄糖酸四个方面。利用其专一氧化酶的原理，制成葡萄糖氧化酶分析仪，能快速准确简易地测定各种食品中的葡萄糖含量，指导生产^[12]。

在医药工业中，GOD作为试剂盒、酶电极等用于血清(浆)、尿液及脑脊液中葡萄糖的体外定量分析；GOD制成的酶制剂还可用于除去或缓解牙斑、牙垢和龋齿的形成防止口腔疾病和牙病的发生^[36]。此外，由于可以催化生成H₂O₂，还可用于对H₂O₂敏感的淋巴瘤的导向目标的治疗。

GOD还是一种新型的酶饲料添加剂，能够改善动物肠道环境，调节饲粮消化，促进动物生长。含葡萄糖氧化酶、乳酸过氧化物和乳铁蛋白的混合饲料添加剂，可用于预防牲畜胃肠道感染、腹泻，并有促进动物生长作用。

由于GOD具有广泛的实用价值，随着GOD在酵母中外源表达的成功，也有人利用定向进化的手段改造GOD，使酶活提高至原来的1.5倍，在热稳定性、pH稳定性方面，也得到了性质改善的突变株。

发明内容

本发明的目的在于提供一种高酶活葡萄糖氧化酶突变株蛋白的编码基因GOD-D401N/A574V，具有SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列以及所述的序列编码的突变酶，该突变酶具有SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列。在黑曲霉GOD结构基因中通过over-lap PCR引入突变，连接于表达载体，生产高酶活GOD突变酶，该突变酶的酶活是野生型的3倍，同时也具有良好的热稳定性和储存稳定性。

本发明的另一个目的在于提供一种高酶活葡萄糖氧化酶突变株蛋白的制备方法，该方法是构建酵母表达载体，利用阴离子交换层析方法纯化高酶活葡萄糖氧化酶突变株蛋白，该方法简便，成本低廉。

本发明的再一个目的在于提供一种高酶活葡萄糖氧化酶突变株蛋白及其在食品和医药上的应用，即一种高酶活葡萄糖氧化酶突变株蛋白在酒中和茶叶保鲜中的应用。。

为了实现上述任务，本发明采用以下技术措施：

本发明的一个目的是提供一种核苷酸序列，该序列编码一种高酶活葡萄糖氧化酶突变株蛋白，具有SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列，其特征在于与野生型相比GOD结构基因上具有1752位的G突变为A和2272位的C突变为T的点突变。由以下步骤制备：

1.突变酶GOD-D401N/A574V突变点的引入

(1)设计两对诱变引物，采用PCR定点突变法在GOD基因上把野生型GOD基因上1752位的G突变为A和2272位的C突变为T；

(2)上述PCR产物经胶回收纯化后，用限制性内切酶SnaBI及NotI进行酶切，与经过相同酶切的质粒pPIC9k片段连接后，转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，获得大肠杆菌菌株DH5α/GOD-D401N/A574V；

2.鉴定重组质粒pPIC9kGOD-D401N/A574V：用酶切、PCR方法对重组质粒进行鉴定，并测序检验，由此得到具有SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列；

本发明命名所得编码高酶活葡萄糖氧化酶突变株蛋白的编码基因GOD-D401N/A574V具有如下特征：

1.本发明所用的GOD野生型基因来自黑曲霉，长度为2303bp，其中结构基因长度为1752bp。

2.具有SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列，与野生型相比在此结构基因上具有两处点突变，即为1752位的G突变为A和2272位的C突变为T。