[发明专利]区分疫苗免疫和野毒感染动物的猪胸膜肺炎放线杆菌血清7型双基因缺失突变株的疫苗及应用

说明书

技术领域

本发明属于动物细菌基因工程技术领域，具体涉及一种区分疫苗免疫和野毒感染动物的猪胸膜肺炎放线杆菌血清7型基因缺失突变株的构建、疫苗制备及应用。 

背景技术

猪传染性胸膜肺炎(porcine contagious pleuropneumonia，PCP)是由胸膜肺炎放线杆菌(Actinobacillus pleuropneumoniae，APP)引起的一种猪传染性呼吸道疾病，给世界养猪业造成了严重的经济损失。自我国发现PCP流行以来，广大兽医工作者对其病原学、流行病学、诊断及防制等方面都进行了一系列研究，取得了一定的成就。但目前该病在我国发病率仍逐年增长，有的猪场阳性率已达到70％以上，已经成为集约化猪场的主要传染病之一，严重危及到我国的养猪业。 

APP是一种革兰氏阴性菌，分为2个生物型，共15种血清型(1-15型)，毒力因子有溶血外毒素(Apx)、脂多糖(Lipopolysaccharide，LPS)、荚膜多糖(Capsular Polysaccharide，CP)、外膜蛋白(Outer MembraneProtein，OMP)、尿素酶(Urease)等。但大量研究证实，溶血外毒素(Apx)是其主要毒力因子，同时也是很好的免疫保护性抗原。APP共产生四种不同的溶血外毒素，即Apx I、Apx II、ApxIII和ApxIV。不同的血清型产生的外毒素不同，除ApxIV外没有任何一种血清型APP能同时产生Apx I、Apx II、ApxIII三种毒素。各种血清型APP所产生毒素种类见表1。 

表1：Apx毒素在不同APP血清型中的分布 

*注：血清型15是最近提出的(Blackall，et al.2002)；血清型13、14所含的Apx尚不十分清楚，但已证实其存在ApxIVA(Bosse，et al.2002)。 

目前在APP中已发现4种不同的Apx具有溶血活性或细胞毒性，即ApxI、ApxII、ApxIII和ApxIV(Frey等.Actinobacillus pleuropneumoniae RTX-toxins：uniform designation of haemolysins，cytolysins，pleurotoxin and their genes.J Gen Microbiol，1993，139(Pt8)：1723-1728；Schal ler A等.Characterization of apxIVA，a new RTX determinant of Actinobacillus pleuropneumoniae.Microbiology，1999，8(Pt8)：2105-2116)。如果要产生和分泌具有生物活性的Apx毒素，需要相邻的按一定顺序排列的四个基因CABD组成的操纵子调控，其中A基因编码毒素结构蛋白，C基因编码毒素激活蛋白，负责对毒素进行酰基化激活，B基因和D基因的翻译后蛋白产物形成跨膜通道，负责毒素由细胞内到细胞外的分泌。ApxI、ApxIII操纵子有完整的CABD基因，而ApxII操纵子只有C基因和A基因，其产物由ApxI的BD基因产物负责分泌到细胞外。 

通过对APP其它毒力基因的缺失或插入失活，人们对一些毒力因子的结构、功能、免疫学意义有一定程度的了解，并获得了一系列有应用前景的突变株，动物实验结果表明：毒力基因缺失的突变株能诱导动 物产生针对不同血清型APP攻击的交叉保护，展示了APP突变株制备的基因缺失疫苗良好的应用前景，同时也提示：通过对毒力因子的深入研究，是大有希望获得广谱、安全、高效的APP基因工程疫苗的。ApxI、ApxII具有溶血活性，ApxI溶血活性强于ApxII，ApxIII没有溶血活性但有很强的细胞毒性。ApxI、ApxII、ApxIII三种毒素对于疾病临床症状的出现以及典型的肺部病变是必需的，这三种毒素在体内外都能表达，对肺巨噬细胞、多形核白细胞、肺上皮细胞和内皮细胞都有不同程度的细胞毒性。除ApxII只含有ApxIICA基因外，ApxI和ApxIII均包括Apx CABD4个基因。其中A基因编码毒素的结构蛋白，C基因编码毒素激活蛋白，激活A蛋白与靶细胞结合并发挥毒素活性，B和D基因产物为毒素分泌时所必需。在不分泌毒素ApxI的APP中同样有apxIBD基因存在，而apxIICA的分泌是在ApxIBD的作用下完成的。