[发明专利]藻红胆素荧光蛋白的制备方法

说明书

技术领域

本发明属于生物技术中色素蛋白质材料领域，具体涉及藻红胆素荧光蛋白的制备方法。

技术背景

藻胆蛋白(phycobiliprotein)是蓝藻和红藻光合作用捕光复合物的功能组分。根据其吸收光谱和荧光光谱特征，藻胆蛋白可以分为藻红蛋白(phycoerythrin，简称CPE)、藻蓝蛋白(phycocyanin，简称CPC)和变藻蓝蛋白(allophycocyanin，简称APC)。CPE、CPC和APC含alpha和beta亚基，每个亚基中藻胆色素(phycobilin)通过硫醚键与藻胆蛋白脱辅基蛋白(apo-phycobiliprotein)的巯基共价结合。藻胆色素与脱辅基蛋白共价结合形成特定的构象，使得CPE主要吸收约560nm的可见光，发射约580nm的荧光；CPC吸收约620nm的可见光，发射约640nm的荧光；APC吸收约650～660nm的可见光，发射约660～670nm的荧光。CPE结合的辅基色素为藻红胆素(phycoerythrobilin，简称PEB)；CPC和APC结合的辅基色素为藻蓝胆素(phycocyanobilin，简称PCB)。

在天然藻胆蛋白中，PCB与CPC和APC的脱辅基蛋白(分别简称为apo-CPC和apo-APC)偶联，而PEB与CPE的脱辅基蛋白(简称apo-CPE)偶联。现在我们发现在一定条件下，PEB能与apo-CPC或apo-APC偶联，形成高荧光的藻红胆素荧光蛋白，此过程能被藻胆蛋白裂合酶CpeS催化。在鱼腥藻(Anabaena)PCC7120(又叫念珠藻Nostoc PCC7120)中，裂合酶CpeS由GenBank编号为alr0617的cpeS基因所编码。

藻胆蛋白可以应用于食品、化妆品、医药和生物工程领域。目前使用的藻胆蛋白仍局限于从藻中提取，如专利CN1680435：一种R-藻红蛋白的快速分离纯化方法；专利CN1587275：一种微藻藻红蛋白分离纯化技术。专利CN200610044582.9：一种重组藻红蛋白及其制备方法和应用，介绍的是apo-CPE的制备方法，而apo-CPE中没有偶联PEB色素，没有荧光。

发明内容

本发明所要解决的问题是针对上述现有技术而提出一种应用基因工程方法来制备藻红胆素荧光蛋白的方法。

本发明为解决上述提出的问题所采用解决方案为：藻红胆素荧光蛋白的制备方法，包括有以下步骤：

1)采用基因工程方法，将apo-CPC的基因：cpcA、cpcB或apo-APC的基因：apcA分别克隆于表达载体中；

2)将此重组的表达载体分别转入到大肠杆菌中，挑取单克隆，从而得到相应的能表达apo-CPC或apo-APC的大肠杆菌工程菌；

3)通过发酵工程按需要大量培养此大肠杆菌工程菌，将所得的大肠杆菌工程菌于磷酸缓冲液中破碎、离心，所得上清液对pH7.5磷酸缓冲液透析，得到apo-CPC或apo-APC溶液；

4)将PEB的二甲亚砜溶液按PEB与apo-CPC或apo-APC溶液摩尔比为1∶1地加入到步骤3)得到的apo-CPC或apo-APC溶液中，在反应温度20～40℃，pH7.5～8.5条件下反应，得到PEB-CPC或PEB-APC粗产物；

5)采用生物工程提纯技术提纯PEB-CPC或PEB-APC粗产物，即得到高荧光的PEB-CPC或PEB-APC。

按上述方案，步骤3)所得的apo-CPC或apo-APC溶液中加入藻胆蛋白裂合酶CpeS溶液，藻胆蛋白裂合酶CpeS溶液的摩尔数与PEB的摩尔数比大于零且小于或等于1。

按上述方案，所述CpeS溶液的制备方法是：

1)采用基因工程方法，将藻胆蛋白裂合酶CpeS的基因：cpeS克隆于表达载体中；

2)将此重组的表达载体转入到大肠杆菌中，挑取单克隆，从而得到相应的能表达藻胆蛋白裂合酶CpeS的大肠杆菌工程菌；

3)通过发酵工程按需要大量培养此大肠杆菌工程菌，将所得大肠杆菌工程菌于磷酸缓冲液中破碎、离心，所得上清液对pH 7.5磷酸缓冲液透析，得到藻胆蛋白裂合酶CpeS溶液。

可以应用吸收和荧光光谱检测上述方法制备的PEB-CPC或PEB-APC荧光蛋白，如图1所示。