[发明专利]肾综合征出血热诊断试纸条、制备方法及检测试剂盒

说明书

技术领域

本发明涉及疾病的诊断技术，特别涉及肾综合征出血热(HFRS)的早期快速诊断技术。

背景技术

肾综合征出血热(HFRS)是由汉坦病毒引起的一种自然疫源性传染病。我国是HFRS的高发区，目前大陆31个省、市、自治区均有病例发生，而且新的疫区不断出现，并偶见爆发流行。该病的临床表现主要是发热、出血和肾脏损害，患者发病初期出现的发热、头痛、全身酸痛等非特异性症状，与一些常见的传染病如流感、钩端螺旋体病等难以鉴别，所以特异性的实验室诊断显得十分重要。

汉坦病毒(Hantavirus，HV)是布尼亚病毒科(Bunyaviridae)的一个属，该属的一些病毒株可引起严重的人类疾病。HV基因组为分节断的单股负链RNA，由L、M、S3个基因片断组成，分别编码RNA聚合酶(RNA polymerase，RNAP)、囊膜糖蛋白(glycoprotein，GP)G1和G2、核衣壳蛋白(nucleocapsid protein，NP)。血清学研究表明，汉坦病毒NP具有很强的抗原性和免疫原性，可以与汉坦病毒内的多种血清型病毒的免疫血清产生交叉反应，表明汉坦病毒的NP具有共同的抗原决定簇，因而常用作汉坦病毒的诊断抗原。NP在核苷酸序列上相对于包膜蛋白更保守，在不同血清型病毒中的同源性较高，整体同源性达到50％，其中蛋白C端有85％的同源性。

HFRS患者体内抗NP抗体出现最早，并且滴度高。此外，来自病毒感染的培养细胞裂解液作抗原，其稳定性、安全性不十分理想，而重组抗原和单克隆抗体的出现进一步提高了检测的敏感性和特异性，为缩短检测时间提供可能。我们采用的NP抗原来源于汉坦病毒株Z10核蛋白，Z10是浙江省卫生防疫站出血热重点实验室于80年代分离的一个病毒株以其制成的I型疫苗，是我国最早被卫生部批准进行人体观察的疫苗，具有血凝滴度高、抗原性强等特点。姚苹苹等[参见：姚苹苹，刘合宾，朱函坪等.汉坦病毒中国疫苗株Z10核蛋白免疫原性的研究.中华流行病学杂志，2001，22(5)：400.]以Z10株核衣壳蛋白基因插入到原核表达载体pET28a，高效表达了核衣壳蛋白，经过IPTG诱导产生抗原性以及稳定性良好的蛋白，进一步纯化后免疫家兔，发现其血清中有较强的免疫荧光抗体以及中和抗体。因此，该基因工程产物作为抗原在安全性、敏感性、特异性都得到保障。

目前，诊断肾综合征出血热常用的实验室检测方法有IgM抗体酶联免疫吸附试验(Mac ELISA)、间接免疫荧光法(IFA)和逆转录聚合酶链反应(RT—PCR)等，由于操作复杂、需要特殊仪器等原因，使其在基层单位的应用受到条件和速度的限制。

发明内容

本发明的任务是提供一种肾综合征出血热诊断试纸条，使其具有简便、快速、特异好、灵敏度高、成本低廉、能在汉坦病毒感染的早期阶段提供特异性诊断依据、且适于推广应用等特点。

本发明的任务还在于提供一种包含本发明试纸条的用于诊断肾综合征出血热的检测试剂盒。

实现本发明的技术方案是：

本发明提供的这种肾综合征出血热诊断试纸条，是在PVC底板7上顺次相互搭接地粘贴样品吸收垫1、胶体金结合垫2、硝酸纤维素薄膜(NC膜)5、吸水垫6而形成的胶体金免疫层析试纸条，其特征在于，胶体金结合垫2由含有胶体金标记的羊抗人μ链抗体免疫金复合物的玻璃纤维素膜构成，硝酸纤维素薄膜5上设置有检测区3和质控区4，在检测区3位置包被有汉坦病毒核衣壳蛋白抗原，该处使用的汉坦病毒核衣壳蛋白抗原为汉坦病毒重组核衣壳蛋白抗原HVrNP；在控制区4的位置包被有兔抗羊IgG抗体。

本发明提供用于诊断肾综合征出血热的检测试剂盒，由本发明提供的肾综合征出血热诊断试纸条、稀释液和使用说明书组成，所使用的稀释液为0.01％吐温-20的PBS溶液。

本发明提供的肾综合征出血热诊断试纸条的制备方法，包括以下步骤：

(1)制备40nm胶体金溶液，用40nm胶体金标记羊抗人μ链抗体，制得胶体金标记的羊抗人μ链抗体免疫金复合物溶液；用金稀释液将该免疫金复合物溶液稀释至42μg/ml，其PH为8.2，以10μl/cm喷于0.5cm×31cm玻璃纤维素膜上，制得胶体金结合垫2，干燥后密封保存；