[发明专利]一种高活力壳聚糖酶制剂的生产方法

说明书

技术领域；

本发明涉及微生物发酵技术和酶工程技术，特别是一种高效表达壳聚糖酶的芽孢杆菌TQK菌株和高活力壳聚糖酶制剂的生产方法。

背景技术

目前，国内外降解制备壳寡糖的方法大致可分为酶降解法、氧化降解法和酸降解法三大类。利用生物酶降解制备壳寡糖的过程明显优于另两种化学降解法，这是由于酶法降解过程使降解产物的分子量分布更容易被控制，能对降解过程进行监控，生产出有效(2-10糖)含量较高的壳寡糖，且降解条件比较温和，无需加入大量的反应试剂，对环境污染较少。热点论坛第6卷第2期报道了李风平等(2003)筛选到1株产壳聚糖的腐皮镰孢菌(Fusariumsolani)菌株，摇瓶表明，产酶要84小时，酶活力45mu/ml；逢玉娟等(2005)筛选到产酶能力强的菌株，72小时菌株YJ102发酵液中壳聚糖酶活力达到17.04u/ml；吴健等筛选到一株半纤维A1号菌株，发酵酶活力达到300u/ml。壳聚糖酶数量众多，但普遍存在酶活性低，酶解底物浓度低(3-10％)，酶解时间长，能耗高等问题。

发明内容

本发明的目的是利用TQS6菌株，通过UV(紫外线诱变)和NTG(亚硝基胍诱变)复合诱变，诱导培养能高效表达壳聚糖酶的芽孢杆菌TQk菌株，及其发酵生产高活力壳聚糖酶的生产方法，从而能高效经济地转化生产壳寡糖。

使用的微生物：本发明涉及的芽孢杆菌TQK，它具有高效表达壳聚糖酶的特性，该菌株于2007年8月14日在中国典型培养物保藏中心保藏，地址.中国.武汉.武汉大学，保藏号为CCTCC No：M207129(以下简称TQK)。

芽孢杆菌TQK菌株的菌学特性：

a、形态特征：单个细胞0.7～0.8×2～3微米、着色均匀。无荚膜，周生鞭毛，能运动。革兰氏阳性菌，芽孢0.6～0.9×1.0～1.5微米，椭圆到柱状，位于菌体中央或稍偏，芽孢形成后菌体不膨大。

b、生理生化特征：菌落表面粗糙不透明，污白色或微黄色、在液体培养基中生长时，形成皱醭；需氧菌；可利用蛋白质、多种糖及淀粉。在壳聚糖的诱导下产生壳聚糖酶，在壳寡糖的生产上起到关键作用。广泛分布在土壤及腐败的有机物中，易在枯草浸汁中繁殖。

本发明是这样实现的。从CCTCC(中国典型培养物保藏中心保藏)取得的TQS6菌株为基础，通过UV(紫外线诱变)和NTG(亚硝基胍诱变)复合诱变，紫外诱变的条件是：紫外灯功率15～30w，照射距离20～50cm，照射时间1～8min。NTG诱变的条件是：NTG浓度1～3mg/ml，在pH6.0的tris缓冲液中，处理90～120min。将菌种接种在含有0.1～0.5％的刚果红平板培养基中，30～35℃，诱导培养24～48小时，可见透明水解圈。培养基配方按质量百分比计为：1.5～2.5％琼脂，壳聚糖1～3％，胰蛋白胨0.5～2％，酵母浸粉0.5～2％，NaCl0.1～0.5％，刚果红0.1～0.5％。

选取水解圈直径H/C菌落直径比值大的菌株，进行摇瓶复筛，通过DNS法测定酶活。平均酶活力达到518μ/ml。

选取优良菌株进行稳定传代3代。最后得到高产壳聚糖酶斜面菌株。并将该菌株命名为TQK，于4℃冰箱中保存。并送中国典型培养物保藏中心保藏，保藏号为CCTCC No：M207129(简称TQK)

发酵产酶工艺包括如下步骤：

(1)一级液体培养：即从斜面到1000ml三角瓶的放大培养，接种量为TQK斜面菌一环，在30～35℃，200～300r/min，PH6.0～7.0条件下，在液体培养基中培养12～24小时。培养基配方按质量百分比计：壳聚糖0～0.5％，胰蛋白胨0.5～2％，酵母浸粉0.5～2％，NaCl 0～0.5％.

(2)7L小罐发酵产酶