[发明专利]一种快速高效的植物人工微RNA表达载体构建方法

说明书

技术领域

本发明涉及的是生物基因克隆表达技术，特别是一种快速高效构建植物人工微RNA(artificial microRNAs，amiRNAs)表达载体的方法。特别适合用于大规模的构建针对植物的不同基因的植物人工微RNA表达单元，以研究植物基因的功能。 

背景技术

随着越来越多的物种全基因组序列测定工作的完成，当前的基因组学研究热点已经由结构基因组学转向了功能基因组学，从而发展能够快速、高效、高通量的基因功能研究方法和策略也自然成为了研究热点。RNA干扰(RNA interference，RNAi)技术由于特异性高，操作简便，重复性好，已成为当今动植物基因功能研究中重要的手段之一，然而由于动植物细胞本身内在的特点，RNAi技术在动物基因功能研究中的应用已经相当广泛和普遍，而在植物中，由于脱靶效应的存在导致其应用相对受阻。近一年多来，陆续有文献报导植物人工微RNA(artificial microRNAs，amiRNAs)能够高效、高特异性地沉默植物的内源和外源基因，而且应用范围比传统的RNAi技术更加广泛。在美国的拟南芥2010计划中，就运用了植物amiRNAs表达技术研究拟南芥中以多基因家族形式存在的基因的功能。 

目前，已知的构建植物amiRNAs表达载体的方法主要有三种：第一种是采用重叠延伸PCR的方法，先按照需要设计三对引物，进行三轮独立的PCR，获得的三种PCR产物分别含有：待干扰的目的基因的靶序列、amiRNAs的环序列以及待干扰的目的基因靶序列的互补序列；然后采用重叠延伸PCR的方法将获得的三种PCR产物拼接成完整的amiRNAs茎环结构序列(见图1)，再将其克隆到植物双元表达载体上。第二种是设计一对引物，该引物分别含有针对目的基因设计的靶序列以及与靶序列互补的序列，且两端分别带有特定的酶切位点，以从植物中获得的microRNA(miRNA)的cDNA序列作为模板进行PCR，获得的产物经酶切酶连处理后克隆到入口载体上，然后采用Gateway重组的方法将amiRNAs的茎环结构序列克隆到植物双元表达载体上(见图2)。第三种是直接合成法。通过以上方法虽然能够成功构建植物amiRNAs表达载体，但是明显存在不足，主要表现在以下几个方面： 

一、步骤繁琐，克隆效率低。以上三种方法都需要对克隆的目的片段和载体进行特殊处理，需要目的片段与载体的连接反应。三种方法中，载体都需要经过合适的酶切、纯化处理。第一种方法需要用三对不同的引物经第一轮PCR获得三段200bp左右大小的DNA片段，对其分别进行纯化处理后，再以该纯化产物为模板进行第二轮重叠延伸PCR，得到完整的amiRNAs结构。由于第一轮PCR产物通常在200bp以下，因此纯化效率较低，成本较高。 而且植物双元载体一般较大(10kb以上)，amiRNAs茎环结构克隆上去之前的酶切、纯化、酶连操作相对困难。第二种方法需要在引物中额外添加针对干扰目的基因设计的靶序列以及amiRNAs的侧翼序列，通常需要长引物(大于60nt)或者多轮的PCR扩增才能获得完整的amiRNAs茎环结构序列，获得的PCR产物也需要酶切，然后与同样酶切处理过的入口载体进行连接反应。这个过程不仅花费时间，而且增加了载体的自连背景，使后续的筛选过程复杂化。第三种方法需要化学合成的两条寡核苷酸单链体外退火，得到的产物需要纯化处理，然后与处理好的载体连接反应；由于待克隆的片段小于100bp，因此难以回收纯化，而且要鉴定正确的重组质粒较难，假阳性率高。 

二、不适合高通量的操作。以上三种方法中的待克隆目的片段都需要预先处理纯化，都依赖于载体与片段的连接反应。这些操作对于构建单个或少数植物amiRNAs表达载体可能有效，但如果大规模构建植物amiRNAs表达载体却非常困难，效率低下。第一种方法中，得到一个完整的amiRNA茎环结构序列需要两对特定的引物，四次独立的PCR和回收步骤，这不仅步骤烦琐，费时费力，而且成本高。第二种方法中使用的引物通常大于60nt，第三种方法需要使用的寡核苷酸单链通常为80～100nt，合成这些长的引物或寡核苷酸单链不仅大大增加了实验成本，而且碱基合成正确率大大下降，从而使得后续的筛选工作成本增加。