[发明专利]一种用于发光光状杆菌的red/ET重组方法

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域，更具体涉及一种用于发光光状杆菌的red/ET重组方法，该方法可用于对发光光状杆菌进行基因修饰。

背景技术

光状杆菌属photorhabdus与异小杆属Heterorhaditis线虫共生，共生菌寄生于线虫肠道内，线虫携带共生菌进入寄主昆虫体内，并将共生菌释放到昆虫血腔中，共生菌在昆虫血腔中繁殖，产生杀虫毒素，在48h内将寄主昆虫杀死，并能产生抗菌活性物质，抑制其他杂菌的污染。共生菌抑菌谱广，已报道共生菌对多种细菌、真菌、酵母菌等(包括植物病原菌、人的病原菌)起抑制作用。发光光状杆菌属photorhabdus已成为当前研究热点，有关发光光状杆菌的基因改良及修饰使其具有更好杀虫效果的研究成为科学家们主攻方向。一种基于λ噬菌体red/ET重组酶的重组方法已应用于大肠杆菌基因工程研究，但从未应用于发光光状杆菌中。Red重组系统由三种蛋白组成：Exo蛋白是一种核酸外切酶，结合在双链DNA的末端，从5′端向3′端降解DNA，产生3′突出端；Beta蛋白结合在单链DNA上，介导互补单链DNA退火；Gam蛋白可与RecBCD酶结合，抑制其降解外源DNA的活性。因此本发明旨在发明一种用于发光光状杆菌photorhabdus luminescens的Red/ET重组方法，便于科学家们对发光光状杆菌基因的改良及修饰进行研究。

发明内容

本发明的目的是在于提供了一种用于发光光状杆菌的red/ET重组方法，该方法具有同源序列短(40-60bp)、重组效率高和操作简单的特点。这种技术可在DNA靶标分子的任意位点进行基因敲除、敲入、点突变等操作，无需使用限制性内切酶和连接酶。

为了达到上述目的，本发明采用以下技术措施：

一种用于发光光状杆菌的red/ET重组方法如下：

所需材料为：

菌种和载体：photorhabdus luminescens DSM15138：购自德国生物材料资源中心(即the German Resource Centre for Biological Material，DSMZ www.dsmz.de)。E.coli YZ2005、pSC101-705-flp-cm^r，pSC101-BAD-αβγA购自德国gene brigdes公司(www.genebrigdes.com)。pASK-IBA购自IBA GmbH(http://www.iba-go.de)。E.coli YZ2005，pSC101-BAD-αβγA和Red/ET试剂盒购自德国gene brigdes公司(www.genebrigdes.com)，pASK-IBA购自IBA GmbH。pASK-αβγA由本发明获得，其特性见表2，用于发光光状杆菌red/ET重组。

工具酶：RNaseA、Proteinase K、限制性内切酶购自New England Biolabs公司。Taq polymerase购自Eppendorf公司。

试剂盒：PCR纯化试剂盒购自Inviteck公司，小量、中量及大量提取质粒试剂盒为QIAGEN公司产品。细菌基因组DNA提取试剂盒为TaKaRa公司产品。用于质粒构建的Red/ET试剂盒由德国gene brigdes公司(www.genebrigdes.com)提供.

抗体：抗Redβ的polyclonal抗体和Anti rabbit antibody-HRP为QIAGEN公司所提供。

其它试剂：NaOH，NaCl，HCl，酒精，甘氨酸SDS，硼酸，HEPES，考马斯亮蓝G250，EDTA，甘油，30％丙烯酰胺/亚甲双丙烯酰胺溶液为MERCK试剂；二甲基亚砜(Dimethyl sulfoxide，DSMO)，Tris base，抗生素，DTT，TEMED，溴酚蓝，二甲苯青，牛白蛋白，(L+)阿拉伯糖(99％)，酚氯仿为Sigma试剂；琼脂粉，酵母提取物，蛋白胨，异丙醇，甲醇，Tween 20为VWR Prolabo试剂；硝酸纤维素膜购于Schleicher&Schuell。DNA分子量标准，蛋白质分子量标准均购于New England Biolabs公司。dNTP Mix购于Promega公司；过硫酸铵为Bio-rad试剂；琼脂糖为Invitrogen试剂。

1)用于发光光状杆菌的red/ET重组质粒pASK-αβγA构建过程如下：

A、带ASK同源臂的PCR产物αβγA的获得