[发明专利]动物布鲁氏菌抗原胶体金试纸膜检测试剂盒

说明书

技术领域

本发明公开一种动物布鲁氏菌抗原胶体金试纸膜检测试剂盒，用 于布鲁氏菌病的诊断，属于动物疫病诊断技术领域。

背景技术

布鲁氏菌是一种革兰氏阴性、特异性胞内寄生菌，能感染许多种 动物和人。目前，根据致病性及宿主的不同将布鲁氏菌分成6个种， 即羊布鲁氏菌、牛布鲁氏菌、猪布鲁氏菌、沙林鼠布鲁氏菌、绵羊布 鲁氏菌、犬布鲁氏菌。其中在世界范围内广泛流行的是牛、羊、猪布 鲁氏菌，对畜牧业危害巨大，更重要的是它们均能引起人的感染，威 胁着公众健康。所以对布鲁氏菌病诊断方面的研究一直受到世界各国 的关注。传统的诊断动物布鲁氏菌病的血清学诊断方法包括：快速滑 动凝集试验(RSAT)、标准试管凝集试验(SAT)、2-巯基乙醇试管凝 集试验(2ME)、补体结合试验(CFT)等。它们都存在着以下不足， 首先，动物布鲁氏菌和其它细菌(如：耶尔森氏菌O9、大肠杆菌O157) 间发生交叉反应现象很难避免；第二，传统检测方法检测费时、费力 且易出现假阳性；第三，传统的诊断方法不能区分布鲁氏菌病的种型。 因此，建立一种简便、快速、特异的诊断方法，对于动物布鲁氏菌病 的诊断、检疫和流行病学调查具有重要的意义。

发明内容

本发明公开一种动物布鲁氏菌抗原胶体金试纸膜检测试剂盒。该 试剂盒可以检测牛、羊、猪布鲁氏菌病抗原，与传统的常规分离培养 方法比，更简便、快速、特异。适用于动物布鲁氏菌病的诊断、检疫 和流行病学调查。

本发明的解决方案是根据抗原、抗体能特异结合的免疫学基本原 理，利用单克隆抗体技术和胶体金免疫层析技术，以动物布鲁氏菌单 克隆抗体IgG作为金标抗体，以动物布鲁氏菌多克隆抗体IgG为检测 线、羊抗鼠IgG为质控线制备成了分别检测牛、羊布鲁氏菌抗原的胶 体金试纸膜，并组装成了试剂盒。试剂盒包括胶体金试纸膜，阴、阳 性试剂，塑料吸管，离心管以及说明书。本发明能够准确区分动物布 鲁氏菌病种型，可同时检测牛、羊、猪种动物布鲁氏菌病。牛、羊胶 体金试纸膜可分别检测牛、羊布鲁氏菌病的抗原，与牛、羊试纸膜均 发生反应的为猪布鲁氏菌病抗原。

试剂盒的具体制作方法如下：

将B.abortus544A和B.melitensis16M布鲁氏菌单克隆抗体株4B8、 2D10进行亲和纯化IgG，纯化后效价为1×10⁶以上，单抗亚型为IgG1、 IgG3和IgG2b，亲和常数为1×10⁷～2.7×10⁸M^-1，抗体IgG含量为 6.12mg/mL～8.45mg/mL，纯度为97.3％～99.5％，以此作为金标抗体。 用纯化的B.abortus544A和B.melitensis16M制备多克隆抗体，经亲和 层析柱纯化抗体IgG，纯化后IgG含量为13.12mg/mL～18.96mg/mL， 纯度达到98.5％～99.1％，多抗效价为1×10⁶以上，以此作为检测线包 被抗体。采用胶体金免疫层析法，制备布鲁氏菌抗原胶体金试纸膜， 结果该试纸膜最低检测限为3×10³～5×10³CFU之间，与耶尔森菌O9、 大肠杆菌O157、沙门氏菌和胸膜肺炎放线杆菌不发生交叉反应；模拟 样本水样的最低检测限为3×10³CFU，土样、奶样为5×10³CFU，4℃ 保质期为12个月。

检测试剂盒由以下结构组成：

(1)试纸膜：

①样品垫：紧密连接于试纸的金标垫；是试纸膜进行检测的部分。 主要接触样品液，利用样品垫的吸附使液体前进，但液面不能超过样 品垫的MAX线。

②玻璃纤维膜：位于样品垫的上部，是金标蛋白固定的材料。布 鲁氏菌病抗原试纸的玻璃纤维吸附有金标探针，即所谓的金标垫。金 标探针是由特异性单克隆抗体IgG结合胶体金而成，可特异性的吸附 样品液中的样本。

③硝酸纤维膜(NC)：位于玻璃纤维膜的上部，膜上喷有间隔的 检测线(T)和质控线(C)。布鲁氏菌胶体金试纸的T线包被为特异 的单克隆抗体IgG，C线分别包被为羊抗鼠IgG。

④吸水纸：位于试纸的最上部，紧连着NC膜。试纸吸附样品液 的动力主要靠吸水纸和样品垫。

⑤塑料垫板：主要起支撑试纸的作用，为硬质塑料板。

(2)阴、阳性试剂：