[发明专利]检测诱骗受体3的双抗体夹心ELISA方法

说明书

技术领域

本发明公开一种检测诱骗受体3的双抗体夹心ELISA方法，用于恶性肿瘤及自身免疫疾病等DcR3相关疾病的临床辅助诊断，属于生物基因工程及疾病检测诊断试剂方法技术领域。

背景技术

诱骗受体3(decoy receptor 3，DcR3，又称TR6)为近年新发现的一种可溶性肿瘤坏死因子受体(TNFR)超家族成员，可与Fas、HVEM、DR3竞争性结合其相应配体FasL、LIGHT及TL1A(Pitti RM，Marsters SA，Lawrence DA，etal.Genomic amplification ofa decoyreceptor for Fas ligand in lung and colon cancer[J].Nature，1998，396(6712)：699-703；Yu KY，Kwon B.Ni J，etal.A newly identified member of tumor necrosis factor receptor superfamily(TR6)suppresses LIGHT-mediated apoptosis[J].J Biol Chem，1999，274(20)：13733-13736；Migone TS，Zhang J，Luo X，TL1A is a TNF-like ligand for DR3 and TR6/DcR3 andfunctions as a T cell costimulator[J].Immunity.2002；16(3)：479-92)，但并不介导细胞凋亡，在细胞的生长、分化、死亡以及免疫调节等方面发挥重要作用，与肿瘤、自身免疫疾病、移植排斥等密切相关。研究表明DcR3在恶性肿瘤如肺癌、食道癌、胃癌、肝癌、胰腺癌、结肠腺癌、EBV相关淋巴瘤、神经胶质瘤组织以及自身免疫病如系统性红斑狼疮、矽肺、进行性系统性硬化病的外周血单个核细胞中存在高表达，而在正常组织不表达或低表达，因而，DcR3有望作为一种新的标志物用于恶性肿瘤和自身免疫病的临床辅助诊断。DcR3属分泌性蛋白，有研究表明肝癌、胃癌等血清中DcR3表达水平与肿块大小、分期及浸润、转移等相关，肿瘤切除治疗后，DcR3水平急剧下降，经过随访，发现与DcR3表达正常的胃癌患者相比，DcR3高表达的患者生存期明显缩短(Takahama Y，YamadaY，Emoto K，etal.The prognostic significance of overexpression of the decoyreceptor for Fas ligand(DcR3)in patients with gastric carcinomas[J]GastricCancer，2002，5(2)：61-68)，因此，术后检测血清DcR3水平有助于观察肿瘤是否切除完全或有无复发及预后判断。

发明内容

本发明公开一种检测诱骗受体3的双抗体夹心ELISA方法，用于恶性肿瘤及自身免疫疾病等DcR3相关疾病的临床辅助诊断。

本发明还提供了一种诱骗受体3基因的构建及蛋白制备工艺。

本发明还提供了一种检测诱骗受体3的单克隆和多克隆抗体的制备工艺，适用于工业化生产。

本发明的技术解决方案如下：

以纯化的多克隆抗体为捕捉抗体，以生物素化的单克隆抗体为检测抗体，建立检测可溶性DcR3含量的双抗体夹心ELISA法。

应用重叠PCR方法获得DcR3基因，构建的pET28a(+)/DcR3重组表达质粒转化入大肠杆菌BL21菌株，IPTG诱导表达His-DcR3融合蛋白，镍柱亲和层析纯化目的蛋白，SDS-PAGE及Western blot分析表达产物。

构建DcR3基因，表达并纯化DcR3蛋白，以DcR3蛋白为抗原制备高效价和高特异性抗人DcR3单克隆抗体和多克隆抗体，并进行鉴定。以纯化的多克隆抗体为捕捉抗体，以生物素化的单克隆抗体为检测抗体，建立检测可溶性DcR3含量的双抗体夹心ELISA法，为肿瘤及自身免疫疾病等DcR3相关疾病的诊断、疗效观察及预后判断提供一种简便、经济的检测方法，为研究DcR3蛋白功能及其在组织细胞表达分布等奠定基础。

具体制备工艺包括以下步骤：