[发明专利]犬、猫科动物重要疫病抗体胶体金银联合检测试纸及其制备技术

说明书

技术领域：

本发明涉及一种犬、猫科动物重要疫病抗体胶体金银联合检测试纸及其制备技术，用于犬猫科动物狂犬病、犬瘟热、猫瘟热和犬细小病毒病等重要疫病的抗体快速检测，属于动物疫病检测技术领域。

背景技术：

犬狂犬病、犬瘟热、猫瘟热和犬细小病毒病等犬、猫科动物重要疫病不仅严重危害我国毛皮经济动物产业，而且严重威胁着虎、狮、狼等多种珍希野生动物的健康，有的还可导致人的发病死亡。要从根本上控制这些疫病，最重要的手段是疫苗的免疫接种，但疫苗接种后动物体内是否产生了达到免疫保护水平的抗体，需要依靠一定技术手段进行检测。对于犬、猫科动物重要疫病，目前国际上常用的抗体检测方法有免疫荧光灶抑制试验、酶联免疫吸附试验、小鼠脑内中和试验、细胞中和试验、血凝-血凝抑制试验等方法，但这些方法都需要一定的仪器设备和较高的操作技术，影响了其推广应用。

胶体金是近年来发展起来的一种检测技术，由Faulk和Taylor(1971)首先用于免疫电镜，现在成了荧光素、放射性同位素和酶标记以外的一大补充。胶体金试纸是利用抗原抗体反应及免疫层析原理，将抗原或抗体以胶体金标记，当待检样品中含有与抗原或抗体特异结合的抗体或抗原时，就会发生聚集而产生肉眼可见的色带，具有简便、快速，结果直观、准确等优点。

发明内容：

本发明提供了一种犬、猫科动物重要疫病抗体胶体金银联合检测试纸，能够简便、快速、准确地检测出犬、猫科动物体内含有的狂犬病、犬瘟热、猫瘟热和犬细小病毒病等重要疫病的抗体。

本发明还公开了上述检测试纸的制备技术，适合于工业化生产。

本发明的解决方案是根据抗原抗体能特异结合的免疫学基本原理，利用胶体金免疫层析技术和银染加强技术，将胶体金标记的羊抗犬和猫IgG混合包被在玻璃纤维素膜上，制成结合垫；将纯化的狂犬病病毒(RV)、犬瘟热病毒(CDV)、猫瘟热病毒(FPV)和犬细小病毒(CPV)等抗原分别包被在硝酸纤维素膜(NC)的检测线R、D、F、P等处，将兔抗羊IgG包被在硝酸纤维素膜的质控线C处，制成检测膜；当被检样品中含有相应病毒抗体时，可先与金标羊抗犬和猫IgG结合，然后在层析作用下与相应检测线上的抗原结合而富集，再经银染液加强染色后形成肉眼可见的色带，进而根据显色结果进行判定。

此外，本发明提供的制备方法，主要涉及以下几个方面的内容：

1、病毒抗原制备：用狂犬病毒(RV)、犬瘟热病毒(CPV)、猫瘟热病毒(FPV)和犬细小病毒(CPV)等分别接种Vero细胞、F81细胞等各自敏感细胞进行培养增殖，然后分别进行浓缩提纯，制备RV、CDV、FPV和CPV等纯化抗原，加保护剂，于-30℃保存备用。

2、羊抗犬和猫IgG制备：用所纯化的犬和猫血清IgG分别免疫羊，制备羊抗犬和猫血清，并提取其IgG，制备羊抗犬和猫IgG，加保护剂，于-30℃保存备用。

3、金标羊抗犬和猫IgG制备：用所制备的羊抗犬和猫IgG分别进行胶体金标记，制备金标羊抗犬和猫IgG，加防腐剂，于4℃保存备用。

4、兔抗羊IgG制备：以纯化的羊IgG免疫家兔，制得兔抗羊免疫血清，并从中提取IgG，制备兔抗羊IgG，加保护剂，于-30℃保存备用。

5、试纸制备与组装：按附图所示，先将金标羊抗犬和猫IgG按一定比例混合后，包被于玻璃纤维素膜，制成结合垫；然后分别将纯化的RV、CDV、FPV和CPV等抗原喷点于硝酸纤维素膜(NC)的检测线R、D、F、P等处，将兔抗羊IgG喷点于NC膜的质控线C处，制成检测膜；最后再按金标层析试纸制备要求，将样品垫、结合垫、检测膜和吸收垫进行粘连、压制和裁切，制成犬、猫科动物重要疫病抗体胶体金银联合检测试纸，装于塑料夹内制成检测卡，加干燥剂分装、封闭于塑料袋内，于4℃干燥保存。

6、银加强法相应试剂的配制：

活化液的配制：以去离子水配制0.05mol/L、PH3.8的柠檬酸盐缓冲液。

银染液的配制：将乙酸银、对苯二酚、阿拉伯树胶溶于去离子水中，使其终浓度分别为0.11％、0.35％-1.7％和7％-10％。

定影液的配制：20％的硫代硫酸钠水溶液。