[发明专利]一种具有大豆MnSOD基因的粟酒裂殖酵母工程菌及其构建方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种具有大豆MnSOD基因的粟酒裂殖酵母工程菌及其构建方法

背景技术

对SOD的研究起始于1938年。1938年英国T.mann和D.keilin最早从牛血液中分离出含铜的兰绿色蛋白，当时称血铜蛋白。1953年从马肝中分离出类似蛋白称肝铜蛋白，后来又从脑中分离出这种蛋白称脑铜蛋白。

1969年Mccord和Fridovich发现该蛋白有催化O₂，发生歧化反应的功能，故将此酶命名为超氧化物歧化酶(Superoxide Dismutase，SOD，EC1.15.1.1)。

超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase，SOD)是生物体防御氧化损伤的一种十分重要的生物酶，能够催化超氧阴离子(O^2-)发生歧化反应，从而专一的清除生物体内的超氧阴离子，平衡机体的氧自由基，较好地抵御氧自由基和其他氧化物自由基对细胞质膜的毒性。

在高等植物中，SOD根据其辅基部位结合的不同金属离子分为三类：MnSOD、FeSOD、CuZnSOD。在植物中CuZnSOD是三种超氧化物歧化酶中含量最丰富的一类，主要存在于叶绿体、胞质和过氧化物酶体中。MnSOD和FeSOD每个亚基都只含有一个金属离子，MnSOD主要存在于线粒体中，而FeSOD存在于叶绿体中。

MnSOD的催化活性不受其产物H₂O₂的抑制。线粒体是真核生物细胞进行有氧呼吸的主要场所，通过其内膜的电子传递链实现能量转换的功能；当生物处于胁迫或病变条件下，线粒体内膜电子传递受阻，将导致活性氧过量产生，对线粒体乃致整个细胞造成伤害。因此MnSOD是细胞线粒体内消除超氧阴离子、保护线粒体不受活性氧伤害的关键酶。

MnSOD是人体内除CuZnSOD之外的另一种SOD，与CuZnSOD相比具有寿命长、分子量小等优点，而且锰的毒性较之铜铁为低，其小分子配合物作为模拟MnSOD安全性好。因而近年来有关MnSOD的研究非常活跃。

在SOD家族中MnSOD的特点是：生物半衰期较长，抗炎抗辐射作用优于CuZnSOD，这表明MnSOD作为酶制剂具有十分重要的医用价值和潜在的临床应用前景。

由于MnSOD仅存于线粒体中，含量甚微，用传统的生物化学方法难以从天然组织中分离纯化较大量的MnSOD蛋白，因此采用分子克隆的方法获得MnSOD的基因序列，并通过转基因的方法使MnSOD基因在酵母中大量表达是深入研究其功能的重要途径。

酵母菌是单细胞真核生物，具有生长快，易于遗传操作、能对外源蛋白进行翻译后加工和修饰、不产生有毒产物等特点，被认为是表达外源蛋白的合适宿主。

裂殖酵母属(Schizosaccharomyces)细胞椭圆形、圆柱形，由营养细胞接合，形成子囊。有发酵能力，代表种为粟酒裂殖酵母，最早分离自非洲粟米酒，能使菊芋发酵产生酒精。粟酒裂殖酵母(fission yeast或Schizosaccharomyces pombe)是一种简单的单细胞生物，其基因组为14Mb，大约是大肠杆菌基因组的4倍。该酵母区别于同属于子囊真菌的酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)，许多研究表明两种酵母在系统分类、细胞周期、rRNA的生物合成和基因的组织、结构及基因的表达调控等方面并不相同，在某些方面裂殖酵母与高等动物却有一定的相似性，因此，裂殖酵母也是一种良好的研究真核生物的模式生物。

发明内容

本发明提供一种具有大豆MnSOD基因的粟酒裂殖酵母工程菌及其构建方法。

本发明采取的技术方案是：将构建的含有大豆MnSOD基因的重组粟酒裂殖酵母表达载体导入粟酒裂殖酵母中得到的。

本发明将MnSOD基因插入到粟酒裂殖酵母表达载体的多克隆位点处，将构建的该重组粟酒裂殖酵母表达载体pESPUC-MnSOD导入粟酒裂殖酵母中，获得重组粟酒裂殖酵母转化子，培养重组粟酒裂殖酵母使MnSOD基因得到表达。

本发明重组粟酒裂殖酵母表达载体pESPUC-MnSOD，该载体含有Pnmt1启动子、Pnmt1终止子序列，抗性基因为氨苄青霉素，选择标记基因LEU，大豆MnSOD基因位于多克隆酶切位点SalI和BamHI之间。

本发明大豆MnSOD基因分别为SEQ ID NO.1，SEQ ID NO.2，SEQ ID NO.3所述。

本发明酵母转化方法是醋酸锂转化法及电击转化法。

本发明中IPTG能诱导MnSOD基因在粟酒裂殖酵母中大量表达。