[发明专利]展示狂犬病病毒保护性抗原的犬Ⅱ型腺病毒活载体重组疫苗

说明书

技术领域：

本发明涉及利用犬II型腺病毒不同结构蛋白的特性，分别展示狂 犬病病毒保护性抗原或抗原表位的重组疫苗，可用于新型动物狂犬病 疫苗的研制和应用。

背景技术：

狂犬病是由狂犬病病毒引起的以非化脓性脑脊髓炎为主要特征 的一种重要人畜共患传染病，感染人和动物后，一旦发病，死亡率几 乎是100％。我国是狂犬病的多发地，每年有上千人死于狂犬病，主 要是由带病毒的犬咬伤引起。尽管目前人用商品疫苗安全有效，但大 量带毒动物的存在仍然对人类生命安全构成了直接威胁。特别是近年 来，死于狂犬病的人数呈逐年上升的趋势。因此，减少或控制狂犬病 病毒在家养动物中的贮集是有效控制人狂犬病发生的重要途径。

目前用于动物狂犬病预防的疫苗主要是灭活疫苗和弱毒疫苗，二 者对预防狂犬病的发生起到了积极重要的作用。但是灭活疫苗免疫周 期短，接种方式单一，不适于动物的田间免疫，而且在我国还没有实 现国产化，进口灭活疫苗制备工艺复杂，成本昂贵，比较适用于发达 国家。弱毒疫苗在敏感动物体内有毒力返祖的危险，不能从根本上消 除狂犬病，因此，难以在我国得到推广。

随着对狂犬病病毒分子生物学特性的不断研究，已证明糖蛋白是 唯一可以诱导机体产生中和抗体的狂犬病病毒结构蛋白。国际上许多 实验室都开展了以糖蛋白为保护性抗原的亚单位疫苗、基因工程亚单 位疫苗、DNA疫苗等新型狂犬病疫苗的研究。虽然这些疫苗可以诱 导特异性中和抗体的产生，并具有一定的免疫保护力，但由于免疫原 性较弱，未得到实际应用。以痘病毒和人5型腺病毒为载体表达狂犬 病病毒糖蛋白的活载体重组疫苗研究取得了一定进展，在欧洲和北美 洲的免疫试验证明，具有良好的免疫原性。但由于存在再次免疫排斥 或安全性问题，而未得到正式批准使用。为提高重组腺病毒疫苗的实 际应用价值，目前，以人5型腺病毒为载体的展示疫苗已有研究，而 以犬II型腺病毒为载体的展示疫苗技术在国内外尚未见报道。

以犬II型腺病毒为载体的重组疫苗对犬科动物易感，也可在猫、 牛和猪等家畜动物体内有效复制，而且遗传特性稳定，安全性好，在 新型狂犬病疫苗的研究中具有较大的开发潜力。本实验室构建的表达 狂犬病病毒糖蛋白的犬II型腺病毒活载体重组疫苗，已获得国家发 明专利，并完成了在生产性试验阶段的生物安全评价，证明具有良好 的免疫效果和安全性。在此基础上，为进一步提高犬II型腺病毒重 组疫苗的免疫效力和实际应用价值，本发明提供了一系列以犬II型 腺病毒结构蛋白展示表达狂犬病病毒保护性抗原或抗原表位的重组 疫苗。

发明内容：

本发明要解决的技术问题是提供展示狂犬病病毒保护性抗原或抗 原表位的犬II型腺病毒活载体重组疫苗。

本发明的技术方案是以犬II型腺病毒为载体，在其结构蛋白基因 的疏水性位点插入狂犬病病毒保护性抗原基因或表达抗原表位的核 苷酸序列，使外源抗原或表位在腺病毒表面与其结构蛋白融合表达。

进一步讲，以犬II型腺病毒疫苗株为载体，在其结构蛋白六邻粒、 纤突或IX蛋白上，利用这些结构蛋白基因自身的转录原件，融合表 达狂犬病病毒保护性抗原或抗原表位，使其在犬II型腺病毒颗粒表 面得以展示，从而达到增强重组疫苗免疫效力的目的。免疫试验证明， 该系列重组疫苗均可诱导产生高滴度的针对狂犬病病毒和犬腺病毒 的中和抗体，并能抵抗狂犬病病毒标准强毒株和犬腺病毒强毒株的攻 击。

首先，在不发生碱基缺失和不影响结构蛋白转录的前提下，对犬 II型腺病毒全基因组中六邻粒、纤突或IX蛋白基因进行改造：

1、过重叠PCR分别在犬II型腺病毒全基因组六邻粒基因超变区 的4个位点，按六邻粒的转录阅读框分别插入狂犬病病毒糖蛋白中和 抗原表位，使其与六邻粒在腺病毒颗粒外表面融合表达；

2、在犬II型腺病毒全基因组28106bp处引入一段人工合成的核 酸序列(含Xma I酶切位点)，在Xma I酶切位点处，按纤突的转录 阅读框插入狂犬病病毒糖蛋白中和抗原表位，使其与纤突在腺病毒颗 粒外表面融合表达；

3、利用犬II型腺病毒IX蛋白基因内的限制性内切酶Ase I位点， 在IX蛋白转录终止密码子处插入狂犬病病毒糖蛋白膜外区基因和 SV40病毒多聚A转录终止信号，使IX蛋白与外源抗原表位利用同 一转录阅读框在腺病毒颗粒外表面融合表达。