[发明专利]人心肌型脂肪酸结合蛋白在大肠杆菌DH5α中的表达和纯化

权利要求书

1、一种人心肌型脂肪酸结合蛋白在大肠杆菌DH5α中的表达和纯化，其表达和纯化是：

a、寡核苷酸引物

根据GenBank的人H-FABP cDNA序列，设计编码H-FABP基因片段的5’和3’端寡核苷酸引物，并在各自5’末端分别引入了EcoR I和SalI限制性酶切位点，引物序列如下：

正向引物：5’-gcg aat tca tgg tgg acg ctt tc-3’；

反向引物：5’-att gtc gac tca tgc ctc ttt ctc-3’；

b、RT-PCR扩增及序列测定

使用Invitrgen的Trizol总RNA提取试剂盒从人心肌组织中提出取总RNA，提取方法按试剂盒说明操作，将RNA溶于50μl DEPC处理水，取10μl人心脏总RNA加2μl Oligo-dT，置70℃ 5min，冰水中冷却5min，然后加4μl dNTP、5μl AMV逆转录酶缓冲液、1μl RNAase inhibitor、2μl AMV逆转录酶，最后加DEPC处理水至终体积25μl，混合均匀，置42℃水浴900min，95℃灭活5min。以上述逆转录的cDNA 15μl为模板，加入上、下游引物，用ABI 2400热循环仪进行PCR扩增，循环参数：先变性94℃ 5min，然后94℃ 45s、57℃ 45s、72℃ 1min，循环30次，最后在72℃延伸7min。1％琼脂糖凝胶电泳，用凝胶回收试剂盒回收目的片段；采用Promega的TA克隆试剂盒将PCR纯化产物克隆至pGEM-T easy载体，构建克隆质粒pGEM-T-H-FABP，进行序列测定；

c、重组表达质粒的构建

以EcoR I和Sal I双酶切pGEM-T-H-FABP质粒，切取脂肪酸结合蛋白片段，与同样以EcoR I和Sal I双酶切的PBV220质粒连接，获得重组质粒PBV-H-FABP，转化DH5α感受态细胞，接种于LB固体培养基平板上，挑取数个菌落，接种于LB液体培养基中，用质粒提取试剂盒提取质粒DNA，酶切鉴定，筛先出阳性克隆；

d、脂肪酸结合蛋白诱导表达

挑取重组菌接种于LB液体培养基中，30℃，200rpm振摇过夜，次日以1∶50接种至LB液体培养基中，继续在30℃条件下振荡培养，至OD₆₀₀值0.4~0.5，将温度调到42℃继续培养5小时，4℃，12000g离心1min，分别收集菌体和上清，菌体中加入缓冲液，超声破碎，12000g离心，再分别取上清和沉淀加入等量的2×SDS变性缓冲液，进行SDS-PAGE电泳；鉴定出高表达质粒并确定诱导表达条件；

e、人心肌脂肪酸结合蛋白的提取纯化

将诱导表达的重组菌经-70℃冰箱中反复冻融，离心收集上清。装入透析袋中用PEG6000浓缩，上样Sephacryl S-100HR和Sepharose G-75柱，用pH.4、150mM NaCl、15mM磷酸钾缓冲液进行洗脱，速度仍为3ml/H。紫外检测仪灵敏度为0.2，记录仪走纸速度为3cm/h，量程为20mV，收集洗脱液，行SDS-PAGE电泳。