[发明专利]吖啶酯和碱性磷酸酶化学发光免疫分析检测心肌钙蛋白T超敏感方法

说明书

技术领域

本发明属于临床免疫分析领域，建立吖啶酯、碱性磷酸酶为标记物的化学发光免疫分析检测心肌肌钙蛋白T的方法，以早期、敏感、特异地诊断急性心肌梗死。此外本发明也可用于实验室作生理、病理、药理、分子生物学等多项研究。

技术背景

心血管疾病是常见病和多发病，是威胁人类健康的首要疾病。急性心肌梗死(acutemyocardial infarction，AMI)是常见的心血管疾病。正确诊断及时救治对挽救濒死心肌，降低急性期病死率，改善预后具有重要意义。在AMI的诊断方面，常用的心电图诊断的准确度仅为24-60％(Fesmire FM.etal.Instability of ST segments in the early stages of acutemyocardial infarction in patients undergoing continuous 12-Lead ECG monitoring.Am J EmergMed，1995，13：158～163)，远达不到临床要求。在生化诊断方面，肌酸激酶(CK)及其同工酶(CK-MB)、乳酸脱氢酶(LDH)等是目前常用的心肌酶谱。但是心肌酶谱并非心脏所特有，在正常人骨骼肌中也有少量存在。非心脏手术或骨骼肌损伤患者CK-MB也可升高，且CK-MB在AMI发病后4-8小时才开始升高，持续时间较短(48-72小时)，临床应用受到限制。1987年英国Cummins等首先报告了用测定周围血中心肌钙蛋白(cTn)的含量用以诊断AMI(Cummins，et al.infarction Am heart J，1987，113：1333-1334)。1991年Katus等人报道了cTnT对诊断AMI具有高度敏感性和特异性(clin.chem.1991；83：902-912.)。近年来研究表明，心肌肌钙蛋白(Cardiac Troponin)是心肌特异的调节蛋白，其亚单位肌钙蛋白T(cTnT)和肌钙蛋白I(cTnI)在AMI时释放入血是心肌损伤的特异性标志物，并具有灵敏度高，在血中出现时间早，诊断窗口时间长等优点。此外cTnT在预测梗塞面积，评价溶栓疗效，AMI预后心功能判定，不稳定心绞痛预后评估，围手术期心肌损伤的判定等方面均具有重要的临床价值。

以往学者们对cTnT诊断AMI的特异性有些争论。1991年katus发现cTnT与骨骼肌有1％-2％交叉反应(clin.Chem.1991；83：902-912.)。但也有学者认为cTnT与骨骼肌的基因编码不同，两者在结构和免疫原方面有很大差异。在检测cTnT的方法改进后，用两种均为心肌特异的单克隆抗体检测cTnT时，与骨骼肌交叉反应阳性率＜0.5％(Katus HA.etal.Clin.chem.1992，38：386)。Baum等人对75名无心脏病的骨骼肌患者(其中33名Duchenne病，42例马拉松运动员长跑后)用改进后的检测方法检测其cTnT，未发现阳性反应(Bodor GS.etal.Clin.chem.1992，38：2203.)。由此可以认为，在无心脏病的骨骼肌患者的血浆中及运动员的血浆中未发现cTnT存在，所以cTnT对诊断急性心肌梗死与cTnI同样具有心肌特异性。然而当发生AMI时，cTnT在升高倍数和持续时间上优于cTnI。由于cTnT在正常人血清中含量很低，在心肌细胞中含量高，一旦少量释放入血浆，cTnT即可升高30-200倍，而cTnI仅升高10-20倍(杨振华：中华医学杂志。1992，72(1)51-52)。另外cTnT在血液和淋巴液中消除速率慢，AMI时cTnT升高可持续2-3周，较cTnI持续时间长。

因为cTnT在血浆中正常含量很低，测定方法需具备较高的灵敏度和很低的检测下限。最初建立的ELISA检测血清cTnT的方法是基于用亲和纯的一种多抗和一种单抗，以后又发展了更敏感更特异的ELISA双单抗一步法，整个反应90分钟完成，检测范围0.1-15μg/L。由于全部采用单抗，检测结果重复性较高，与骨骼肌交叉反应＜0.5％(Katus HA.etal.Clin.chem.1992，38：386)。快速定性测定方法采用金免疫层析法(郑佐娅，陶义训，上海医学检验杂志，1996，11，57-58。)。