[发明专利]融合阿维菌素及红霉素合成基因簇的组合生物合成应用

说明书

技术领域

本发明涉及组合生物合成，特别是一种融合阿维菌素及红霉素合成基因簇的组合生物合成应用。对不同种聚酮类化合物的合成基因簇上游或下游进行抗生素标记，通过细胞融合技术，可以得到阿维菌素的结构类似物。本发明提供了产生新的抗生素结构类似物的微生物的方法，可以用来寻找和发现可用于医药、工业或农业的化合物、抗生素、基因或蛋白。

背景技术

组合生物合成(combinatorial biosynthesis)是一种有针对性的对某些基因进行操作从而获取大量“非天然”天然性化合物的方法，其研究是建立在各种化合物在生物体内的生物合成途径的基础之上，是微生物新药研发的新技术之一。聚酮类化合物的组合生物合成是该技术应用较为深入的领域。组合生物合成方法的可行性最早在Hopwood等人的工作中得到论证。根据放线紫红素(actinorhodin)的生物合成基因簇，Hopwood等人分别克隆了部分和全部的这些基因到曼德尔霉素(medermycin)和二氢榴菌素(dihydrogranaticin)的产生菌中。在曼德尔霉素产生菌的转化株Streptomyces sp.AM-7161中，除产生曼德尔霉素外，还产生了大量的新化合物曼德尔紫红素A(mederrhodin A)，它在放线紫红素的特征基础上额外携带了一个羟基。在二氢榴菌素产生菌的转化株Streptomyces violaceoruber Tü22中，也产生了一种新的化合物，二氢榴红菌素(dihydrogranatirhodin)，它在异色满醌体系的不同立构中心上分别拥有放线紫红素和二氢榴菌素的构象。这次尝试使将天然产物的组合生物合成设想首次变成现实。在此之后，文献中不断有大量的涉及面较宽泛的此类例子出现，同时这种方法在实现天然产物的化学多样性方面也被公认为是一种有用的工具。组合生物合成特别适合实现化学方法难以达到的分子构建，尤其对于较复杂的结构。特别是在聚酮化合物的研究上，一方面可以进行骨架结构改变，例如，更改环体系、链长度或者不同构建模块的合并；一方面可以引进外围的改变，如糖基化、氧化和还原、甲基化、异戊二烯化、卤化以及酰基化。近几年，组合生物合成技术更是不断发展、应用范围不断扩大。

两种抗生素：阿维菌素(avermectin)，因其独特的作用机制以及高效、低毒、安全性高和对环境影响小等优点，使得这一大环内酯类抗生素成为目前世界上使用最广泛的驱线虫和除杀外寄生虫抗生素，特别是该类抗生素在防治节肢动物类寄生虫病方面具有其它抗生素不可替代的功效。但是，阿维菌素对细菌和真菌无抗菌活性。而红霉素(erythromycin)对革兰氏阳性菌有较强的抗菌活性，对革兰氏阴性菌也有抗菌作用。

发明内容

本发明的目的在于提供一种融合阿维菌素及红霉素合成基因簇的组合生物合成应用。对不同种聚酮类化合物的合成基因簇上游或下游进行抗生素标记，通过细胞融合技术，可以得到抗生素阿维菌素的结构类似物。本发明可以用来寻找和发现可用于医药、工业或农业的化合物、抗生素、基因或蛋白。

本发明的进一步目的在于提供一种产生新的抗生素结构类似物的方法，运用该法可将不同种抗生素的合成基因簇分别在上游或下游进行抗生素标记，通过细胞融合技术，筛选同时具备两种抗性的融合细胞，获得可以产生新的抗生素结构类似物的微生物。可用于医药、工业、农业的化合物的创新与发展。

本发明提供了一种新的抗生素阿维菌素结构类似物的生物合成基因簇，编码其生物合成涉及的基因包括：

阿维菌素合成基因簇上游处的任一段基因，满足此基因的失活不会影响菌株的生长发育以及抗生素的生产主要功能；

阿维菌素合成基因簇下游处的任一段基因；

红霉素合成基因簇下游处的任一段基因，满足此基因的失活不会影响菌株的生长发育以及抗生素的生产主要功能；

卡那霉素抗性基因与氨苄霉素抗性基因。

本发明提供了一种新的抗生素阿维菌素结构类似物的生物合成基因簇，编码其生物合成涉及的基因具体如下：

1)aver-1：504bp和aver-2：507bp，位于阿维菌素产生菌除虫链霉菌(Streptomycesavermitilis ATCC 31271)中阿维菌素生物合成基因簇上游SAV934和aveR基因之间的相邻的两段基因；

aver-C：651bp，位于阿维菌素产生菌除虫链霉菌(Streptomyces avermitilis ATCC 31271)中阿维菌素生物合成基因簇下游aveG和yerD1基因之间的一段基因；