[发明专利]滚动载荷用于培养物培养的方法及生物反应器

说明书

【技术领域】

本发明涉及细胞工程和组织工程领域，特别是一种滚动载荷应用于细胞、组织培养和保持的方法及相关的生物反应器。

【背景技术】

随着组织工程的发展，人们对移植物和培养物培养条件的生物力学(biomehanics)和力学生物学(mechanobiology)研究越来越重视。最近几年相关研究者对不同的力学刺激，以优化培养物的结构和功能做了大量研究。国内有研究者采用静张应力对大鼠髁突软骨细胞增殖效应进行研究，实验表明细胞增殖数量随静张应力增高而升高[华西口腔医学杂志，2003，21(1)，57-60]；也有研究空气压应力对体外培养软骨细胞分泌细胞因子的影响[解剖学报，2001，32(4)，385-387]，离心力在体外构建组织工程软骨中的作用[中华实验外科杂志。2005，22(3)，281-283]，周期性流体应力刺激对组织工程软骨分化影响的实验研究[骨与关节损伤杂志，2003，18(9)，620-622]。这些加载方法可以促进细胞增殖或功能发挥，但和真正软骨受载是有差别的。Mauck等[J Biomech Eng，2000；122(3)：252-260]把软骨细胞接种在琼脂糖凝胶进行动态直接施压，载荷大小是使复合体变形10％，频率为1Hz，探索功能化软骨组织工程的培养，4周后发现GAG(氨基葡聚糖)升高45％，胶原含量增加37％，明显高于未加载组。Buschmann等施加1Hz，应变3％的动态压载荷进行软骨构建，实验表明硫酸软骨素增加15％-25％，脯氨酸增加10％-25％，同时，在这种力学条件下研究不同培养时间培养物弹性模量的变化。

实现组织工程化培养，生物反应器是至关重要条件。生物反应器为体外组织工程构建提供合适的生长条件，使工程化组织获得与活体组织有相似的结构与功能。合适的生物反应器的研制除考虑生化因素外还取决于对组织结构与功能关系的理解程度。

当前的生物反应器对细胞培养、组织和细胞-支架培养物培养、保持，通常使用的有四种反应器：即静态、旋转培养瓶、旋转壁式生物反应器和灌流式生物反应器[Advanced Drug Delivery Reviews 33(1998)15-30，Tissue Engineering.2003，9(3)，549-553，不同种子细胞、新型支架材料、生长因子等构成培养物，分别在这几种生物反应器中培养，主要是促进培养物形态、结构的生长。尽管现有技术中各种生物反应器的使用优化了培养物的生长，但培养物的生长、发育还是没达到临床要求。如生物反应器在组织工程化培养中，也包括各种力学环境的应用，人工组织发育不良，力学性能差、细胞退化、死亡等问题。这些问题的解决一方面需要使用当前生物反应器更进一步的实验，以及其它相关领域的发展，如细胞生物学研究，支架材料的研制，活性因子的制造；另一方面需要生物反应器培养条件的优化。力学环境在生物反应器的研制占有重要位置，力学因素影响生物体的整体，器官、组织、细胞和分子水平等各层次的生物学过程[Guilak et al.Functional Tissue Engineering，2003，Springer]。力学条件的优化十分重要。比如关节软骨组织受到压载荷作用，受到剪切力作用，但滚动载荷更能体现关节受力的本质。人在行走时关节处受到复杂力的作用，关节有大部分时间处于滚动过程，因此滚动作用可能是关节软骨合适的力学环境，因此滚动载荷的加入可能优化生物反应器的力学条件。

专利WO2004/046304给出了压力和剪应力耦合作用的生物反应器；发明专利(申请号200480038317.9，公开号CN 1898375A)介绍了用于对具有三维形状、活性和机械抗力的细胞移植体进行培养和刺激的方法和生物反应器。以软骨组织工程为例，Schulz和Bader，Ivan Martin总结了组织培养时的环境[TRENDS in Biotechnology Vol.22No.2，2004，pp80-86；Eur Biophys J，DOI 10.1007/s00249-007-0139-1，2007]。包括(a)为电场；(b)锥形粘度计条件，细胞在旋转锥形体下方受到剪切力作用；(c)旋转壁式生物反应器给细胞提供微重力环境，传质过程较好；(d)单项灌流系统；(e)拉伸条件；(f)水压及灌流条件；(g)直接压缩。其后介绍了各种培养条件的耦合系统；特别是各种力学条件的联合使用。但都没有涉及滚动加载的培养。其它组织的培养中，如皮肤按生理过程也需要滚动加载的培养.

【发明内容】