[发明专利]以增强型绿色荧光蛋白为报告基因的BIV指示细胞系

说明书

【技术领域】

本发明涉及一种用于检测牛免疫缺陷病毒感染的细胞系，以及该细胞系的建立方法和它的具体应用。

【背景技术】

牛免疫缺陷病毒(Bovine immunodeficiency virus，BIV)与人免疫缺陷病毒(Humanimmunodeficiency virus，HIV)同属于反转录病毒科慢病毒属，与HIV基因组高度同源，其遗传、复制方式、与宿主细胞的相互关系、致病机理等与HIV极其类似，用其作为一种艾滋病研究模型，用于探讨慢病毒基因表达调控、慢病毒与其它病毒超感染后病毒间以及病毒与宿主细胞间的相互作用，具有很高的安全性。建立BIV指示细胞系是研究BIV的分子生物学的有力工具。

指示质粒稳定转染可以被病毒感染的细胞系，该细胞系称为指示细胞系。该细胞系的基因组含有被病毒反式激活因子的应答元件调控的报告基因，病毒感染或病毒的反式激活因子可以特异性启动病毒反式激活因子的应答元件下游的报告基因的表达，通过检测报告基因产物，指示病毒的感染。传统的在细胞培养中病毒感染的识别方法主要有观察细胞病变法。细胞病变法测定的病毒滴度依赖实验者的肉眼观察，主观性较大，不同实验者可能得出不同的结果。与传统的检测方法相比，指示细胞系具有快速，简便，灵敏的特点。

【发明内容】

本发明的目的是提供一株可以快速简便地检测牛免疫缺陷病毒或病毒反式激活因子的指示细胞系以及该细胞系的应用。

本发明提供的牛免疫缺陷病毒(Bovine immunodeficiency virus，BIV)感染的指示细胞系，已于2007年5月16日保藏于“中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心”(北京市海淀区中关村北一条13号中国科学院微生物研究所)，其保藏号为CGMCC No.2050。

本发明提供的细胞系的制备方法如下：

首先构建成一个可以应答牛免疫缺陷病毒感染的指示质粒，其具体核苷酸序列如序列表1所示，即将增强型绿色荧光蛋白(EGFP)的基因插入到一种特异应答牛免疫缺陷病毒反式激活因子的应答元件下游，质粒含有G418抗性基因。所述的特异应答牛免疫缺陷病毒反式激活因子的应答元件是BIV LTR中U3和TAR区，不含有负调控区域U5区。

将该质粒转染幼仓鼠肾细胞(Baby Hamster Kidney cell，BHK-21)，加入G418进行筛选稳定表达的细胞系，初筛三周后，将抗性细胞进行单克隆化；通过转染BIV反式激活因子24小时后用荧光显微镜观测绿色荧光来分别鉴定每个单克隆特异响应BIV反式激活因子的能力，最终挑选无本底表达但经过BIV病毒攻击后EGFP表达量高的阳性克隆即为BIV的指示细胞系。

本发明的检测牛免疫缺陷病毒或病毒反式激活因子的新方法是：BIV感染或BIV反式激活因子Tat转染BIV指示细胞系，BIV指示细胞系的增强型绿色荧光蛋白(enhancedgreen fluorescent protein，EGFP)基因表达，使细胞发出绿色荧光，在荧光显微镜下观察绿色荧光间接指示BIV的感染或BIV Tat的激活，激活作用也可以用流式细胞仪定量检测。

该细胞系应用可示例于如下：研究BIV Tat及JDV Tat的激活机制，研究BIV原克隆的感染性，研究病毒的超感染，检测BIV病毒在上清或冻融裂解液中的感染性，鉴定某种因子对BIV复制的抑制或促进作用，鉴定某种因子对BIV Tat的抑制或促进作用。

本发明的优点和积极效果：

本发明细胞系具有以下优点：以EGFP为报告基因，无需外加底物或裂解细胞，操作简便易行；可以通过荧光显微镜实时观察，了解感染的动态过程；可以通过流式细胞仪定量检测；在病毒感染或反式因子转染12小时后细胞即可观察到绿色荧光，即使一两个绿色荧光细胞也可以检测出来，灵敏快速。

本发明的应用价值在于：

(1)BIV分子生物学研究的有力工具。对BIV的深入了解，有助于了解同属反转录病毒的HIV的分子特性，推动慢病毒的基础研究。

(2)应用于JDV的分子生物学的研究。JDV是近年新发现的一种使牛急性发病的反转录病毒，但目前对其了解甚少。JDV基因组与BIV有很高同源性。JDV Tat同样能够激活BIV LTR，应用指示细胞系可以指示JDV Tat的激活作用。

(3)BIV与HIV的分子生物学特性相近，但BIV不感染人，可以不用在P3实验室操作。应用该指示细胞系和BIV病毒建立抗反转录病毒感染的药物筛选模型，对有抗AIDS活性的药物进行初筛，从而降低研究的安全风险，操作简便。