[发明专利]人、大鼠、小鼠HSP70双抗夹心法检测试剂盒

权利要求书

1.一种人、大鼠、小鼠HSP70双抗夹心法检测试剂盒，包括盒体、设在盒体内的固化HSP70单克隆抗体的酶标板和设在盒体内的物质，盒体内的物质包括HIS-HSP70蛋白标准品、生物素标记的HSP70多克隆抗体、样品稀释液、洗涤缓冲液、抗体稀释液、辣根酶标记亲和素、辣根酶标记亲和素稀释液、底物显色液A液、底物显示液B液和终止液；

所述HIS-HSP70蛋白标准品是用下述方法制成：

先设计上游引物：5‘CGGAATTCATGGCCAAGAAAACAGCG 3’，下游引物：5‘CCCAAGCTTCTAATCCACCTCCTCGAT 3’，PCR扩增，双酶切连入PET-32a载体中，转化大肠杆菌，IPTG诱导表达，纯化，SDS胶鉴定纯度，透析后冷冻干燥，即制成HIS-HSP70蛋白标准品，分装，-70℃冻存；

所述生物素标记的HSP70多克隆抗体是用下述方法制成：

(1)制备HSP70多克隆抗体：选用健康雌性家兔为免疫动物，用2mg/ml的所述HIS-HSP70蛋白作为免疫抗原，4℃保存；进行免疫注射程序，将0.5ml免疫抗原加0.5ml弗氏完全佐剂，充分混合，在兔子背部皮下多点注射，每点0.2ml，下肢腹股沟0.2ml；一个月后，将0.5ml免疫抗原加0.5ml弗氏完全佐剂，充分混合，在兔子背部皮下多点注射，每点0.2ml，下肢腹股沟0.2ml；再一个月后，用0.5ml免疫抗原耳静脉注射；再7-10天后，颈动脉全采血，分离血清，加入质量百分浓度为0.8-1.2％的硫柳汞水溶液，-70℃下保存，得HSP70多克隆抗体血清；采用硫酸铵沉淀法纯化HSP70多克隆抗体血清；

(2)对HSP70多克隆抗体进行生物素标记：

1)制备生物素N-羟基丁二酰亚胺酯：取生物素1g混悬于10-18ml N，N-二甲基甲酰胺，加入0.4-0.8gN-羟基丁二酰亚胺和0.6-1.0g二环己基碳二亚胺，置于密闭容器内，室温下磁力搅拌作用8-12小时，过滤，滤液经旋转蒸干，加8-12mL乙醚洗涤，继加160-220ml异丙醇使其重结晶，获得白色粉末状晶体，-30℃分装冻存；

2)生物素与HSP70多克隆抗体藕联：

①取所述生物素N-羟基丁二酰亚胺酯粉末，以二甲亚砜制备成1-2mg/ml溶液，备用；

②将纯化的HSP70多克隆抗体以0.1mol/L pH9.00的NaHCO₃配成2-4mg/ml溶液；

③将步骤①与步骤②制备的溶液按体积比为1∶4-8混合，20-30℃搅拌3.5-5.5h；

④4℃条件下使上述混合液体以0.05mol/L，pH7.2 PBS透析8-12小时，加等体积甘油，-20℃分装存放；

所述固化HSP70单克隆抗体的酶标板是用下述方法制成：

用2mg/ml的所述HIS-HSP70蛋白作为免疫抗原，选用18-20g的Balb/c雌鼠作为免疫动物，并取其脾细胞与SP2/0细胞融合，ELISA筛选、亚类鉴定、腹水制备，纯化单克隆抗体，将纯化的单克隆抗体包被酶标板，4℃保存。

2.根据权利要求1所述的一种人、大鼠、小鼠HSP70双抗夹心法检测试剂盒，其特征是所述样品稀释液的组成为：每100ml含有NaCl0.5g，KCl0.0125g，KH₂PO₄ 0.0125g，Na₂HPO₄ 0.181g，余量为水。

3.根据权利要求1所述的一种人、大鼠、小鼠HSP70双抗夹心法检测试剂盒，其特征是所述洗涤缓冲液的组成为每100ml含有NaCl 5g，KCl 0.125g，KH₂PO₄ 0.125g，Na₂HPO₄1.81g，吐温-20 20ul，余量为水。

4.根据权利要求1所述的一种人、大鼠、小鼠HSP70双抗夹心法检测试剂盒，其特征是所述抗体稀释液的组成为：每5ml含有小牛血清500ul，质量百分浓度为1％硫柳汞水溶液100ul，100mM的铁氰化钾50ul，吐温-20 2.5ul，10mg/ml的庆大霉素25ul，余量为pH7.4的0.01M的PBS。