[发明专利]观赏竹芋组织培养无菌体系获得的新方法

权利要求书

1.一种观赏竹芋组织培养无菌体系获得的新方法，其特征在于：利用组 织培养母本植株的二次过渡栽培和外植体综合灭菌及在培养基中添加消毒杀 菌剂共培养以获得无菌体系的改良方法；植物组织培养是在无菌条件下实施， 其过程包括：

1)母本植株进行二次过渡栽培，即在珍珠岩中栽培2～3周后；再移至 水中进行水培，诱导含有较少内生菌的新芽后，取其新芽作为外植体进行组 织培养；

2)对材料进行初步消毒和低温预处理；

3)在诱导培养基中添加2种不同用量的消毒杀菌剂，制备出能抑菌的诱 导培养基；

4)外植体进行表面消毒；

其具体方法为：

(1)引进盆栽的观赏竹芋种苗，剪去部分老根和老叶，洗净栽培基质，在 500～800倍多菌灵溶液中浸泡20min，稍晾干后栽培于已洗净的大粒珍珠岩 的竹筐中，用喷壶浇足水分，每天保湿，室温保持在25～30℃；每隔4～5天 喷洒1次500～800倍多菌灵溶液；

(2)无土栽培2～3周后，取出植株，洗净栽培基质，并剪去部分老根和 老叶，用塑料定植篮固定植株，再移至水中进行水培，玻璃瓶中水位不能太 高，只需淹没根系长的1/3即可，水中加入5～10ml专用水培营养液，将培养 材料置于满足植物生长的温度、光照条件的房间或设施，温室内进行培养； 每隔4～5天喷洒1次500～800倍多菌灵溶液；3～4周后，在茎节植株处能 形成4-6厘米的新芽，以此新芽作为初步灭菌的外植体；

(3)先对材料进行预处理：从水培容器中取生长旺盛的竹芋植株，除去根 与叶，用自来水冲洗干净后，用0.1％的高锰酸钾溶液浸泡5min，取出毛巾将 根状茎抹干，再放入0.1％的多菌灵溶液浸泡5min；把带芽茎段置于冰箱的4 ℃～5℃处理1d后，用10m g/L培福朗溶液预处理16～24h备用；

(4)室内配制含有消毒杀菌剂的抑菌诱导培养基：消毒杀菌剂为：一种性 质稳定，耐高压灭菌并能与其它抗生素配合使用的广谱生物杀菌剂SDAs，添 加量为0.2～0.3％，和丙酸钠0.3％～0.5％；并将培养基的pH值由5.8调至4.3～ 4.5；

(5)外植体诱导材料的表面消毒：外植体消毒用70％～75％的乙醇溶液0.5～ 1.0min，3.0～5.0％的次氯酸钠和0.1％的升汞1∶1混合溶液浸泡12～ 14min，混合溶液中加2滴吐温-80，通过磁棒搅动或不断震荡摇动，无菌水 冲洗5～6次，减少对材料的杀伤作用，用解剖刀剥除芽鳞片，每剥一层鳞片， 用0.1％升汞浸泡1.0min，，无菌水冲洗三次，直至剥至露出生长点为止；将 已消毒的生长点放入含0.2～0.3％杀菌剂SDAs的1/4MS无机盐中浸泡10～ 16min后接种；

(6)接种后日常管理：将培养材料置于满足植物组织培养的温度：25±1 ℃、光照条件：2000～2500lux；16h/d光照的房间或设施；温室内进行培养；

(7)改善环境条件：接种室与培养室要定期做好消毒与净化，接种前工作 台或接种箱要开紫外灯30min以上；培养室的相对湿度应控制在70％，相对 湿度太高时用抽湿机抽湿；

(8)接种人员应严格执行无菌操作，对接种中所需的工具，必须经严格灭 菌后才能使用；在超净工作台的操作区内，不要放入过多的待用材料，避免 气流被挡住；还要定期检查超净工作台的工作质量；

(9)严查接种材料，淘汰被真菌与细菌污染的接种材料；

(10)经常检查消毒锅的灭菌质量，若发现问题要立即检修；

(11)检查培养容器是否存在问题；培养容器封口用塑料盖、胶塞、棉塞、 薄膜，塑料盖用久了易老化，密封性差，会造成污染。