[发明专利]带有阳离子识别基团的蛋白质印迹树脂的制备方法及应用

说明书

【技术领域】：本发明属于蛋白质印迹树脂的合成及其应用技术领域，特别涉及以克隆蛋白质为模板用带有阳离子识别基团的辅助识别的限长聚合物链(辅助识别聚合物链)合成蛋白质印迹聚合物，具体地应用于天然微量蛋白质的分离、富集。

【背景技术】：分子印迹技术是聚合物通过“记忆”印迹分子的立体空间而具有的分子水平上的专一性识别能力。由于蛋白质结构的特殊性及生物活性的要求，近年来印迹蛋白质成为分子印迹领域研究的热点。利用非共价作用是印迹蛋白质最简单方法。常用的弱分子间作用力有：氢键、静电力、电荷转移、疏水作用以及范德华力等。

印迹蛋白质的方法主要有包埋法、表面印迹法、抗原决定基的方法。早期采用最多的聚合方法是包埋法，印迹的蛋白质通过蛋白酶的降解去除，印迹聚合物可以重新吸附印迹分子。Hjérten等(Hjérten J，Liao J L，Nakazato Ketal.，Chromatography，1997，44：227-234)采用该法，以丙烯酰胺为单体合成了低交联度的凝胶，对血红蛋白、生长激素、红细胞色素、肌红蛋白和核糖核酸酶等进行了印迹。洗脱印迹分子后得到了具有良好选择性的分子印迹聚合物，不同的印迹分子能被相应的凝胶所吸附。

表面印迹法制得的介质使印迹识别位点处在颗粒的表面(或表层)，克服了包埋法印迹分子利用率低、印迹分子洗脱困难、介质内部扩散阻力大、介质形态不规则等缺点。从蛋白质的结构和特性来看，表面印迹法更适合印迹蛋白质分子。其优点是可利用粒子的机械稳定性及调节粒子本身性能以适应不同的印迹需要。表面印迹法印迹蛋白质的载体有硅胶粒子、云母、聚合物微球等。硅胶作载体的优点是在聚合过程中硅胶表面的修饰基团通过价键距离控制，只有相应底物有强烈识别作用，可大大降低非特异吸附对选择性的影响。但用聚合方法制备的微球作载体(Ye L，Cormack PAG，Mosbach K.Anal Chim Acta.2001，435：187-196)可通过对初始聚合阶段工艺条件的控制，得到尺寸均一，有良好机械性能的聚合物颗粒，不用粉碎和筛分，能保证得到的印迹聚合物的物理和化学性能。表面印迹法一般是在微球上进行印迹或涂层印迹聚合物，或是将蛋白质首先吸附到云母上(ShiH，Tsai W B，Ferrari S，RatnerB D.，Nature，1999，398：593-597)，然后将一薄层的二糖分子包被在吸附的蛋白质上，糖层与蛋白质通过氢键结合。接着在糖分子表面聚合上一层光滑的荧光聚合物薄层。最后除去云母并溶解掉印迹蛋白质，即生成了具有蛋白质形状空穴的聚二糖表面印迹聚合物。Sergey等(Bossi A，Piletsky S A，Piletska E V，et al.Anal.Chem.，2001，73：5281～5286)提出表面接枝印迹方法是在聚苯乙烯树脂表面涂一薄层稳定的可键合的物质，该物质在蛋白质分子存在下可聚合。

抗原决定基的方法根据抗原和抗体仅仅是通过一小部分即抗原决定基来相互作用的原理而建立的一种方法，所谓的抗原决定基是由三到六个氨基酸残基组成的表面区域(Rachkov A，Minoura N.Biochi et Biophy Acta，2001，1544：255-266)。如果使用代表蛋白质或多肽结构的小部分裸露片段的短肽作为模板，就会产生与该短肽相匹配的空间大孔，从而分子印迹聚合物就会识别含有该短肽部分的整个蛋白质分子。抗原决定基方法的缺点是不仅可以识别模板分子，还可以识别其他的具有与模板分子相同序列的氨基酸和蛋白质。

上述目前普遍使用的印迹蛋白质方法都具有明显的缺点：单体聚合发生在有机溶剂中，用以印迹的蛋白质种类少且均为常见的、在生物体内含量很大或很容易得到的蛋白质，这限制了蛋白质印迹聚合物的应用的实际意义。