[发明专利]一种应用于肿瘤细胞和干细胞共培养的新方法

说明书

所属技术领域

本发明涉及一种肿瘤细胞与干细胞相互作用的体外实验新方法，尤其是涉及肿瘤细胞与干细胞的非接触式共培养。

背景技术

间充质干细胞(mesenchymal stem cells，MSC)是指存在于骨髓基质中的非造血组织的另一类重要的干细胞，它最显著的生物学特征是既有自我更新的能力，又具有向多种中胚层和神经外胚层来源的组织细胞分化的潜能。它有着广泛的来源：包括骨髓、骨骼肌、软骨、骨、肌腱等，故在干细胞研究领域中具有突出的优势，具有非常重要的理论研究意义和临床应用价值。

我们希望通过以transwell模型为基础，建立MSC细胞和恶性黑色素瘤细胞的非接触式共培养模型，观察不同培养模型中的MSC形态，检测多种指标免疫组织化学染色结果、分析差异，初步表明与恶性黑色素瘤细胞非接触式共培养的部分MSC表型发生改变，明确非接触式共培养可以应用于MSC和恶性黑色素瘤细胞之间相互作用的研究。

本实验中培养的间充质干细胞紧密贴壁生长，形态较均一，其形态特征基本上为梭形的成纤维细胞状，符合骨髓间充质干细胞形态。细胞CD34及VIII因子阴性，排除了造血细胞和内皮细胞的可能性。综合分析上述结果证明本次实验对照模型中培养的细胞符合小鼠骨髓间充质干细胞的特点，是未产生分化小鼠骨髓来源间充质干细胞。

血管内皮是指血管内壁覆盖的一层上皮细胞，具有许多重要标志，主要包括：VIII因子关连抗原(yon willebrand factor，vWF)，可以由全身所有血管内皮细胞产生，检测这一因子主要用相应的抗体。vWF具有很高的特异性，通常认为它是反映内皮细胞的最好指标，如人的vWF抗体对牛的内皮细胞没有交叉反应。

本次实验中非接触式共培养的MSC光镜下部分细胞为多角形或短梭形；免疫组织化学和免疫荧光结果呈现CD34阳性，VIII因子阳性，并且通过统计分析得到共培养模型与对照模型在CD34和VIII因子2个指标上均有显著差异(P＜0.01)。以上结果初步证实与B16非接触式共培养中的MSC部分细胞发生向内皮细胞方向分化。

此次实验借助transwell模型建立了非接触式共培养模型，此种培养模型排除了以往接触式共培养模型的细胞混杂不利于后期观察和区分结果的弊端，细胞分类明确，变化一目了然。而且当培养模型中细胞间相互作用需要通过建立细胞间紧密连接和/或需要采用旁分泌的作用方式时，则不会引起靶细胞变化。根据非接触式共培养的特点，可以进一步推测恶性黑色素瘤细胞是否通过向共同培养体系中分泌较高含量的某种或某些细胞因子对MSC产生作用，导致MSC的分化。

综上所述，本实验通过新建的体外非接触式共培养模型，初步表明与恶性黑色素瘤细胞非接触式共培养的部分MSC表型发生改变，明确非接触式共培养可以应用于两种细胞间相互作用及作用方式的研究。虽然，通过本方法还无法说明B16诱导MSC分化的具体方式以及确切机制，但是我们认识了MSC在肿瘤血管形成中的作用，以及非接触式共培养在研究细胞间相互作用及作用方式的重要意义。

发明内容

通过建立MSC细胞和恶性黑色素瘤细胞的非接触式共培养模型，观察不同培养模型中的MSC形态，检测多种指标免疫组织化学染色结果、分析差异，初步表明与恶性黑色素瘤细胞非接触式共培养中的部分MSC表型发生改变，明确非接触式共培养可以应用于MSC和恶性黑色素瘤细胞之间相互作用的研究。

本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：主要利用0.4μm孔径的Transwell培养板建立非接触式共培养模型。