[发明专利]铜绿假单胞菌鞭毛运动相关基因PA2950及应用

说明书

【技术领域】：本发明属于微生物生物技术领域，特别涉及一种铜绿假单胞菌鞭毛运动相关基因PA2950。

【背景技术】：铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)属假单胞菌属，革兰氏阴性菌，它是一种分布广泛的条件致病菌，在临床上，它能引起菌血病、耳、眼、皮肤及软组织、骨及关节、心内膜和呼吸系统等的感染，是人类的三大致病菌一，是引起肺炎的首要致病菌。由于其具有形成生物被膜等多重耐药机制，耐药率高，常在临床上引起顽固性、难治性感染，成为临床治疗的棘手问题。

铜绿假单胞菌具有单端鞭毛，运动活泼。鞭毛作为主要的运动器官，对铜绿假单胞菌提高营养物质的获得，逃避毒性物质，转移到合适的寄主，找到合适的固着位点和向环境扩散传播起着重要作用。生物被膜降低了药物的通透性，与耐药性紧密相关，在生物被膜的形成过程中，鞭毛的运动对最初的固着与扩散过程起着至关重要的作用。对铜绿假单胞菌鞭毛运动相关基因进行研究，确定各基因的功能，为揭示其鞭毛运动机理和鞭毛在生物被膜形成中、在自然界传播中作用的机理提供基础，为临床治疗和耐药防治提供理论依据。

有关铜绿假单胞菌鞭毛运动相关基因的功能研究，国内尚无报道，国外研究对此方面有一定的涉及，其研究主要是在控制鞭毛数目基因、调节鞭毛蛋白合成的调节因子等方面，但对于鞭毛运动相关基因的功能、各基因间如何调节表达尚存在不少疑点，缺少系统的研究。本研究从这一点出发，探索与鞭毛运动相关基因的功能，阐明其运动相关基因之间的作用机理。

【发明内容】：本发明目的是提供铜绿假单胞菌鞭毛运动相关基因PA2950，并用该基因为新药靶点研制抑制铜绿假单胞菌的新型药物。

本发明提供的铜绿假单胞菌鞭毛运动相关基因PA2950，其核苷酸序列如序列表所示，其基因长度为1197bp，位于铜绿假单胞菌基因组282节3309411-3310607。

上述的铜绿假单胞菌鞭毛运动相关基因PA2950可以用于以该基因为新药靶点设计并制备抗菌药物，以及在食品卫生和耐药防治方面的应用。

本发明基因PA2950的获得方法：使用人工Mu转座技术(一种基于噬菌体Mu转座子的转座技术)，造成铜绿假单胞菌基因突变，建立突变子文库。筛选泳动能力丧失的突变子，使用Bam HI酶切基因组DNA，酶切片段与pUC18载体连接，通过电转化将连接产物导入大肠杆菌DH5α，用卡那霉素和氨苄青霉素双抗LB平板筛选阳性转化子，测定突变株中插入片段的核苷酸序列，发现Mu插入的基因，确定此基因与铜绿假单胞菌鞭毛运动有相关性。

本发明的有益效果：

实验发现，本发明提供的基因PA2950缺失或失活后，能够使鞭毛介导的泳动能力丧失。

Mu插入失活的基因泳动能力丧失，说明此基因与铜绿假单胞菌鞭毛的运动有关，这对鞭毛运动相关新基因的发现以及揭示新基因的功能都有指导意义。

通过本发明，可以针对PA2950基因设计药物，限制其正常表达，使得细菌无法通过鞭毛运动形成生物被膜，降低其耐药性，达到治疗铜绿假单胞菌引起的感染的目的。

【附图说明】：

图1是泳动能力丧失的阳性转化子的蹭动运动检测图，其中，1、野生型PA68作为阳性对照，2、PA2950::Mu PA68突变株。

图2是Mu克隆子酶切产物电泳图，1、DL15000 2、质粒3、质粒酶切。

图3是Mu转座子PCR产物电泳图(用PCR方法检测转化子的Mu转座子)，其中，4、DL2000，5、Mu克隆子PCR产物。

用Mu-kam P1和Mu-kam P2作为引物，克隆子质粒DNA为模板，可以扩增出700bp的特异性片段，说明所检测的克隆子质粒中携带着插入了Mu转座子的基因片段。

【具体实施方式】：

实施例1：使用Mu转座技术进行突变子文库的建立

(1)将临床分离株铜绿假单胞菌PA68接种于50ml L-broth培养基(10g/L胰蛋白胨，5g/L酵母粉5g/LNaCl)中，37℃，200rpm振荡培养过夜。

(2)次日按1∶100接种至200mlL-broth培养基中，200rpm，37℃培养至OD₅₄₀≈0.5，终止培养。

(3)于2℃ 7000g离心10min，收集菌体。

(4)依次用等体积、1/2体积、1/5体积在冰浴中预冷的300mM蔗糖溶液重新悬浮、洗涤菌体，2℃8000g离心10min，倒净残液。