[发明专利]海藻酸－碳酸钙杂化凝胶固定β－葡萄糖醛酸苷酶的方法

说明书

技术领域

本发明涉及酶的固定化技术，特别是一种海藻酸-碳酸钙杂化凝胶固定β-葡萄糖醛酸苷酶的方法。

背景技术

海藻酸凝胶是一种常用的固定化酶载体。目前，海藻酸凝胶固定化酶主要采用包埋法。包埋法条件温和，生物相容性好，有利于维持酶的结构完整性，进而提高酶的活性维持率，而且载体孔径较大，有利于反应物和产物传递。

海藻酸凝胶固定化酶通常存在的问题是载体的孔径较大，酶分子容易泄漏。凝胶形成过程中存在“脱水收缩”现象，一部分酶会随水排出载体。凝胶易溶胀，机械强度差，循环使用稳定性和储存稳定性不高。解决问题的方法通常是利用双功能基团交联剂如戊二醛等进行交联，使凝胶载体更加致密，或是利用无机粒子预吸附酶分子，然后进行包埋，制备有机-无机杂化固定化载体。

中孔二氧化硅材料是固定化酶时最常用的吸附剂，但研究表明，这类中孔材料尽管具有较大的比表面积和孔体积，但是一般孔径较小，吸附较大尺寸的酶分子效果不好。另外由于合成方法所限，一般的中孔二氧化硅均带负电，与带负电的酶分子存在静电斥力，影响吸附效果。中孔碳酸钙具有较大的孔径且带有正电，同时制备简单，材料廉价易得，适合固定化以葡萄糖醛酸苷酶为代表的具有较大尺寸和负电性的酶，因此在固定化酶领域具有广泛的应用前景。

发明内容

本发明的目的在于提供一种利用海藻酸-碳酸钙杂化凝胶固定β-葡萄糖醛酸苷酶的方法。以该方法所制得的固定β-葡萄糖醛酸苷酶杂化载体，β-葡萄糖醛酸苷酶的泄漏率低，载体溶胀度低，重复使用性好。

本发明提供的一种海藻酸-碳酸钙杂化凝胶固定β-葡萄糖醛酸苷酶的方法包括以下步骤：

(1)等体积等浓度的碳酸钠溶液和氯化钙溶液室温下混合搅拌，静置，碳酸钙粉末沉淀依次用水和丙酮洗涤，空气中自然干燥，得到微米级中孔碳酸钙颗粒；

(2)在β-葡萄糖醛酸苷酶的三羟甲基氨基甲烷-盐酸(Tirs-HCl)缓冲液中或起水溶液中加入碳酸钙颗粒，室温下吸附，离心分离，得到吸附葡萄糖醛酸苷酶的碳酸钙颗粒；

(3)海藻酸钠溶液与制得的吸附葡萄糖醛酸苷酶的碳酸钙颗粒混合均匀，再滴加到氯化钙溶液中，老化，得到海藻酸-碳酸钙杂化凝胶固定β-葡萄糖醛酸苷酶的颗粒。

本发明提供的海藻酸-碳酸钙杂化凝胶固定β-葡萄糖醛酸苷酶的方法包括以下步骤：

(1)将100ml 0.33M的碳酸钠溶液迅速倒入等体积等浓度的氯化钙溶液，室温下高速搅拌30s，然后停止搅拌，静置15分钟，将所得的碳酸钙粉末离心，依次用去离子水和丙酮洗涤，空气中自然干燥，得到微米级中孔碳酸钙颗粒；

(2)将β-葡萄糖醛酸苷酶溶于浓度为0.05mol/L的三羟甲基氨基甲烷-盐酸(Tirs-HCl)缓冲液中或去离子水中，配制成浓度为0.5mg/mL的β-葡萄糖醛酸苷酶溶液，然后将15mg碳酸钙颗粒与1mlβ-葡萄糖醛酸苷酶溶液混合，室温下吸附2h，离心分离得到吸附葡萄糖醛酸苷酶的碳酸钙颗粒；

(3)将海藻酸钠溶于去离子水制成2.0％的溶液，取5ml与按照步骤(2)制得的吸附葡萄糖醛酸苷酶的碳酸钙颗粒混合均匀，用注射器滴加到0.2M的氯化钙溶液中，老化30min，得到海藻酸-碳酸钙杂化凝胶固定β-葡萄糖醛酸苷酶的颗粒。

本发明提出的制备方法的优点在于：制备条件温和，制备工艺简单易行，所得杂化载体对酶具有很好的固定能力，固定化β-葡萄糖醛酸苷酶的泄漏率低，溶胀度低，重复使用稳定性好。

附图说明

图1为实施例1制备的海藻酸-碳酸钙杂化凝胶固定β-葡萄糖醛酸苷酶的颗粒的扫描电镜(SEM)照片。

图2为实施例二制备的海藻酸-碳酸钙杂化凝胶与海藻酸空白凝胶的溶胀度变化图.

图3为实施例1制备的海藻酸-碳酸钙杂化凝胶固定的β-葡萄糖醛酸苷酶的循环使用酶活力的变化图。

具体实施方式

实施例1