[发明专利]用种子类原球茎诱导四倍体秋石斛兰新品种的方法

权利要求书

1.一种用种子类原球茎诱导四倍体秋石斛兰新品种的方法，其特征在于包括以下步骤：采用人工授粉后胚龄的未成熟秋石斛兰种子，在1/2MS液体培养基中进行非共生萌发培养，在培养60天后，换入含有0.02％Oryzalin(C₁₂H₁₈N₄O₆S)的1/2MS液体培养中处理，后转入1/2MS固体培养基上，光照下，继续培养，直至秋石斛兰苗形成，按常规的方法进行秋石斛兰栽培移植和管理，直至开花。

2.一种用种子类原球茎诱导四倍体秋石斛兰新品种的方法，其特征在于包括以下步骤：

1)秋石斛兰的人工授粉：秋石斛兰按常规方法进行栽培管理，在开花后的5～10天进行人工授粉，授粉后的秋石斛兰，放在通风、半透光条件下进行管理，温度保持在15～20℃，湿度30～50％；

2)秋石斛兰种子非共生萌发培养：在人工授粉后150～180天，取秋石斛兰种子，用剪刀剪下蒴果，在超净工作台内用75％酒精消毒1分钟，再用0.1％升汞消毒10分钟，无菌蒸馏水冲洗5遍，沿果实纵轴方向切开，将秋石斛兰种子接种在1/2MS液体培养基中振动或静止非共生萌发培养；

3)秋石斛兰多倍体诱导：将非共生萌发的秋石斛兰种子转入含有0.02％Oryzalin(C₁₂H₁₈N₄O₆S)的1/2MS液体培养基中，诱变处理。

4)秋石斛兰多倍体幼苗培养：将诱变处理后的秋石斛兰种子转入1/2MS固体培养基上继续培养，直至秋石斛兰苗形成。

5)秋石斛兰苗多倍体的鉴定：在瓶苗移栽时，按株编号，分别取新生长的根尖，放入对二氯代苯饱和水溶液中，前处理4小时，后转入甲醇∶冰醋酸(3∶1，体积)固定液中固定4小时以上，4℃冰箱中保存备用；用压片法制备染色体标本，用卡宝品红染色液染色，显微镜观察染色体数目，选取染色体数目为2n＝76的幼苗，是加倍成功的同源四倍体秋石斛幼苗；

6)四倍体秋石斛兰的栽培管理：将加倍成功的秋石斛兰苗，进行移植，按常规的秋石斛兰栽培管理，直至开花。

3.按照权利要求2所述的用种子类原球茎诱导四倍体秋石斛兰新品种的方法，其特征在于步骤1)在秋石斛兰花开花5～10天内进行人工杂交授粉，取自花或同株异花花粉进行授粉。

4.按照权利要求2所述的用种子类原球茎诱导四倍体秋石斛兰新品种的方法，其特征在于步骤2)所述的非共生萌发培养是在黑暗或弱光下，室温25～27℃条件下进行非共生萌发培养60天。

5.按照权利要求2所述的用种子类原球茎诱导四倍体秋石斛兰新品种的方法，其特征在于步骤3)所述的诱变处理是在培养60天后，当种子类原球茎(PLBs)发育成球形时，即原胚期，进行多倍体诱变处理150-180小时。

6.按照权利要求2所述的用种子类原球茎诱导四倍体秋石斛兰新品种的方法，其特征在于步骤4)所述的继续培养是在光周期14小时/天，光强度3000Lux，室温25～27℃条件下进行。

7.按照权利要求2所述的用种子类原球茎诱导四倍体秋石斛兰新品种的方法，其特征在于步骤6)所述的移植方法：待瓶苗长至3-4片真叶后，打开瓶盖进行练苗3-5天，然后用清水轻轻地洗去培养基，移栽在兰花土+火烧土+松针土(重量比为1∶1∶1)基质中，放在阴凉处，按一般石斛兰花进行精心管理，防止病虫害。