[发明专利]一种枯草芽孢杆菌及其应用

说明书

技术领域

本发明涉及一种枯草芽孢杆菌及其菌剂的应用，属于一种广谱生防、促生菌剂。

背景技术

半个多世纪以来，化学农药防治病虫害对农业生产起了十分重要的作用。但是，随着化学农药的长期和大量使用带来的农药残留、环境污染、病虫的抗药性等问题的出现，化学农药的安全性引起了社会的普遍关注，生物防治越来越受到人们的重视。生物防治具有对人畜安全，无毒害，不污染环境等优点，逐渐成为植物病虫害防治的重要措施之一。在植物病虫害生物防治中，尤以苏云金芽孢杆菌(Bt)防治鳞翅目害虫最为成功。目前，开发利用生物杀菌剂防治农作物病害已成为生防领域的研究热点。在该领域，具有防病效果的微生物包括：芽孢杆菌、木霉、放线菌等，其中以枯草芽孢杆菌的研究开发最为活跃，在微生物杀菌剂市场中备受瞩目。枯草芽孢杆菌是一种在自然界广泛存在的微生物，革兰氏阳性，产生耐热、抗逆的芽孢，在芽孢形成初期分泌各种抗菌物质，对病原真菌有特异性的防治作用，具有显著的生防潜力。枯草芽孢杆菌具生长快、营养简单，有利于生防菌剂的生产、剂型加工及在环境中的存活、定殖与繁殖，而且批量生产工艺简单，成本也较低，施用方便，储存期长，是一种理想的生防微生物。目前已明确的枯草芽孢杆菌作为生物杀菌剂的抑菌机制有以下几个方面：一是营养和空间位点的竞争；二是分泌抗菌物质。目前已确定来自枯草芽孢杆菌的抗菌物质有低分子抗菌肽，有环状肽或环状脂肽，也有些为线状肽等，这些物质能使病原真菌菌丝发生断裂、解体、细胞质消解等现象；三是促进植物生长，增强植物的诱导抗病性。尽管很多枯草芽孢杆菌生防制剂已被证实具有防治作用，但仅有少数几种应用于生产，大部分仍处于研究和探索阶段。

发明内容

本发明的目的在于提供一种枯草芽孢杆菌菌株以及该菌株的干粉菌剂在农业病害防治、水果保鲜等领域中的应用。

本发明的目的是通过以下方式实现的：

本发明人从田间玉米病叶片上分离到一株对玉米小斑病菌C小种有拮抗作用的细菌菌株，经鉴定属于典型的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)，但与其它枯草芽孢杆菌相比其具有广谱抗病原真菌活性，同时其干粉菌剂对鲜桃、葡萄等水果保鲜效果较好，用于黄瓜、番茄、等大棚蔬菜的生产不仅有抗病效果，而且又有促生作用。为了证明该菌株的广谱抗病原真菌活性，发明人做了以下工作：

一、枯草芽孢杆菌CGMCC No.1982菌株的鉴定、诱变及拮抗机理

1、菌株的形态

显微镜下观察发现，该菌株菌体杆状，产生芽孢，革兰氏反应为阳性。在TSA培养基上菌落呈浅黄色，近圆形，表面干燥、有褶皱，不透明。

2、菌株的生理生化特征

生理生化实验鉴定表明，该菌株为好氧菌，接触酶阳性，V-P实验阳性，能产生淀粉酶，对盐有一定的耐受性；不能利用丙二酸盐；不产生卵磷脂酶。

3、菌株16S rDNA序列的测定

利用PCR技术扩增该菌株的16S rDNA序列，获1514bp全长片段。将测序结果与GeneBank中已知的16S rDNA进行同源性比较，发现与Bacillussubtilis(登录号：AY887082)的同源性最高，为99％。

根据菌体革兰氏染色、菌落形态特征的观察、生理生化测试及16S rDNA序列分析结果，该菌株和枯草芽孢杆菌相吻合，因此将其鉴定为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)。

4、菌株的复合诱变及抗菌活性提高

采用紫外线和氯化锂对菌株进行复合诱变处理，获得了遗传性状稳定的诱变菌株，其对致病真菌玉米小斑病菌的拮抗活性比出发菌株提高了66.2％。

5、菌株拮抗物质的理化特性分析

将菌株接种于LB液体培养基，30℃振荡培养48h，用高速离心机12，000r/min离心5min去菌体，上清液加入30％饱和度的硫酸铵，4℃静置过夜后，12,000r/min离心25min，取上清液，加入硫酸铵使达到60％饱和度，4℃静置过夜后，12,000r/min离心25min，得到具拮抗活性的蛋白性质粗提物。

对拮抗物的理化特性分析表明，菌株产生的拮抗物质能耐高温(100℃，10min)，抑菌活性pH值范围为5.0～9.0，对紫外线、胰蛋白酶部分敏感，对蛋白酶K、氯仿敏感，说明该拮抗蛋白稳定性较好。

6、菌株拮抗物质的拮抗机理