[发明专利]一种厌氧微生物分离培养方法

说明书

发明领域

本发明涉及一种厌氧微生物的分离方法，尤其是一种极端微生物生理生态研究、自然生态研究，遗传工程研究，生命科学研究，病理学研究，海洋地质研究和环境污染治理中不可缺少的新方法。

背景技术

在自然生态系统中，微生物扮演着非常重要的角色。在污染治理中，微生物可以分解很多其他方法不能去除的有机或无机污染物，且成本低廉；在地质学研究中，不同区域的特定种类的极端微生物的亲缘关系，可能标志着这些区域以往的位置关系。但微生物往往是以菌群为单位，多种微生物生存在一起，因此，分离获得微生物的纯培养是微生物生理生化研究中必须首先解决的问题。一个新的微生物菌种的发现，往往会导致微生物学的重大进展，也可能会引起一个新的学科交叉点：比如硝酸盐还原菌与硝酸盐废水的治理，幽门螺旋菌与胃癌的治疗等。其中，极端环境下的微生物往往是环境、能源、地质研究中比较重要的角色，可以给科研工作者提供很多新的思路和方法。但由于其培养的环境条件难以在常规条件下得到模拟，极端环境下的微生物往往是难以纯化培养，尤其是要求几种极端条件同时具备的情况，如要求极端厌氧环境和高温环境同时具备。

微生物的分离和纯化的方法及专利有很多，如一次性微生物分离诊断鉴定培养基(专利号：200520003682.8)，一种微生物分离培养方法(专利号：94103474.7)等，但这些分离方法中，多数为针对分离好氧菌或兼性厌氧菌。

厌氧菌分为非严格厌氧菌和严格厌氧菌：暴露于氧气中会造成生长抑制的细菌为非严格厌氧菌，暴露于氧气中造成菌体死亡的称为严格厌氧菌。不同厌氧菌对氧气的耐受能力不同，一般以耐氧时间作为指标。在耐氧时间内，不会造成菌体死亡，菌体的耐氧时间差异很大，从几秒钟到数十小时不等。对于耐氧时间极短的细菌，由于在分离操作的过程中很容易因接触氧气而造成菌体死亡，人们往往很难分离到，只能用探针的方法去检测其核酸片断，无法得到纯培养细菌。而耐氧时间短的细菌多数生活在极端环境中，如在深海中由于巨大的水压，细菌不会和氧气接触。极端环境微生物往往是一个新的物种，对科学研究的意义重大；而且由于极端条件下的样品很难获得，所以，从极端条件下分离到的微生物十分珍贵。但是，这种对厌氧条件的严格要求造成了分离厌氧菌的极大的障碍。如果没有得到细菌的纯培养，人们就难以在自然的条件下去研究该厌氧菌的代谢机理，对厌氧菌进一步研究受到制约。在对厌氧细菌的检索中，有很多细菌均被称为“未培养细菌”。这说明对于厌氧细菌来说，现有的分离技术还有很大的局限性。

目前已报道分离厌氧细菌的方法主要有：

1)利用厌氧工作站对细菌进行分离培养，可以保证分离的全过程中，目的细菌与氧气隔绝，但是，目前的厌氧工作站中一般设定的培养温度上限为50℃，难以给嗜热厌氧菌提供足够的培养温度。而且即使欲分离培养50℃以下生长环境的细菌，一个厌氧工作站只也能设定一个培养温度，分离培养不同温度的微生物就需要多个厌氧工作站，极大的提高了实验成本。同时，厌氧工作站中难以提供严格的无菌环境，培养时，培养皿之间容易互相染菌。

2)利用厌氧罐、厌氧袋及滚管操作分离厌氧微生物，可以提供细菌50℃以上的培养温度，但整个操作过程暴露于空气中，目的厌氧菌会与氧气接触，造成目的菌体死亡。

3)文献《一种分离培养硫酸盐还原菌的改进方法》(万海清，应用与环境生物学报，2003，9(5)：561-562)中介绍了叠皿夹层法分离厌氧微生物，但该方法在涂布操作过程中，菌体会短时间内暴露于空气中。如果预分离的细菌的耐氧时间较少，将会造成目的菌体的死亡。

4)文献《对一种新的厌氧菌培养皿-OxyplateTM的评估》(赵虎 等，上海医学检验杂志，2002，06)中介绍了利用OxyplateTM培养皿分离厌氧菌的方法，该方法同样存在于涂布操作过程中，菌体短时间暴露于空气中，造成菌体死亡。

5)专利一种适合厌氧培养使用的培养皿，(专利号：200420074957.2)，该专利针对医疗基层机构中厌氧致病菌的发现和培养，致病菌往往生存在非严格厌氧的环境中，利用这种培养皿分离耐氧时间短的细菌，可能会造成菌体死亡。

发明内容

本发明的目的是：提供一种简单且准确的高温厌氧菌分离方法，该方法能够在操作全程中避免目的厌氧菌菌体与空气接触，并且可以分离50℃以上培养温度的高温厌氧菌。

本发明的具体解决方案为：

1)将含指示剂的琼脂培养基及带密封盖的玻璃管灭菌；