[发明专利]一种固定化细胞聚丙烯酰胺大孔凝胶载体及其制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及固定化细胞载体及其制备方法，特别是涉及一种用于固定微生物细胞的聚丙烯酰胺大孔凝胶固定化材料及其制备方法。

背景技术

固定化酶技术是通过物理或化学的方法将酶连接在一定的固相载体上成为固定化酶的技术，而固定化细胞技术是在固定化酶技术的基础上发展起来的一种生物固定化技术，是将完整的细胞连接在固相载体上，既免去了破碎细胞提取酶的程序，又保持了酶的完整性和活性的稳定。相比固定化酶技术，固定化细胞技术不但能够保持酶的原始状态，加强稳定性，而且本身是多酶系统，无需辅酶再生，因而也节省了酶分离费用；此外，固定化细胞技术还具有细胞浓度高、流失少，菌体细胞易于分离，可多次重复使用，操作简单和浪费少等优点，在生物工程、环境工程等领域具有良好的应用前景。目前，常用的细胞固定化方法主要有吸附法、包埋法、交联法和截留法等，可根据不同的固定对象和应用需求选取不同的固定化方法，其中吸附法和包埋法是固定细菌(如纤维素降解菌等)的主要方法。表面吸附固定法的优点是能有效的保持产酶微生物(主要是真菌)的生长和产酶活性，并且载体可以重复利用。然而，用吸附法固定微生物细胞时，pH值、细胞壁的组分、载体的性质等均可影响细胞与载体之间的相互作用，只有当细胞的性质、载体的特征及细胞与载体间的作用等参数配合恰当时，才能形成稳定的微生物细胞-载体复合物，此外，细胞与载体之间的结合力较弱，操作的稳定性也较差，因而吸附法在实际应用当中仍存在一定的技术问题。包埋法是将微生物封闭在天然高分子多糖类或合成高分子凝胶的网络中。细菌、酵母等完整细胞的固定化一般采用聚丙烯酰胺、海藻酸钠和卡拉胶或聚合物凝胶作为载体，其中聚丙烯酰胺由于传质性能和化学稳定性均相对较优，成为最为常用的固定化材料。然而传统化学交联聚合法由于聚合过程放热，从而对菌体的活性有较大的影响，并且交联剂和残留的单体如丙烯酰胺，对包埋的菌体具有毒性作用，因而也将影响到菌体的活性。因此，在传统常温聚丙烯酰胺载体制备法的基础上发展了冷冻聚丙烯酰胺载体制备技术，可以明显降低底物和氧的传质扩散阻力，使微生物受丙烯酰胺单体的毒害作用降低，具有更高的产酶活性。但是，冷冻聚丙烯酰胺载体制备技术中的聚合和交联过程在空间上存在不均匀性，由此导致形成的凝胶孔隙大小和孔隙度的不均匀，并且该技术对温度条件要求严格，聚合反应温度越低，孔径就越小，传质效率就越低；反之聚合反应温度越高，孔径就越大，载体的强度就越低。因此，利用冷冻技术制备固定化细胞载体的操作相对困难，难以进行大规模制备和应用。基于目前的研究，丙烯酰胺单体用化学聚合或辐照聚合后得到的凝胶，孔径一般在0.5μm以下，而具有纤维素降解能力的细菌直径在1μm以上，真菌菌丝体则更长，并且大多分泌的是胞内酶，而细菌的纤维素酶位于细胞膜上，细菌需要附着到纤维素上方能对其进行降解，因此按照传统方法制备的固定化细菌无法直接降解纤维素。因此，现有的固定化细胞载体的制备方法对菌体活性存在抑制作用、操作过程难以精确控制、且因载体孔径过小还会阻碍菌体与底物接触等技术问题，特别是对纤维素降解菌的细胞固定化技术尚不成熟。

发明内容

本发明的目的是一种既能够使部分菌体扩散与底物充分接触又能够使部分菌体固定于载体，且能重复利用的固定化细胞聚丙烯酰胺大孔凝胶载体。

本发明所提供的固定化细胞聚丙烯酰胺大孔凝胶载体，是先制备含丙烯酰胺单体和N，N’-亚甲基双丙烯酰胺(BIS)单体的混合溶液，然后向该混合溶液中加入NaCl至饱和，再将上述溶液移至凝胶载体制备容器中，均匀加入NaCl粉末直至高出液面2-5cm，随后排除溶液和容器中的氧气，密封容器，再用放射线辐照使丙烯酰胺单体和N，N’-亚甲基双丙烯酰胺单体聚合，最后将经辐照聚合后获得的凝胶进行水浴后得到的既可用于液相接种又可用于固相接种的固定化细胞聚丙烯酰胺大孔凝胶载体。

所述溶液中丙烯酰胺单体的浓度为90-100g/L，N，N’-亚甲基双丙烯酰胺单体的浓度为4-6g/L。

所述NaCl粉末的粒径可根据所要固定的目的微生物细胞随意选择，如10-1000μm。

所述放射线可为Co⁶⁰源γ射线或X射线等，优选为Co⁶⁰源γ射线。

本发明的第二个目的是提供一种上述固定化细胞聚丙烯酰胺大孔凝胶载体的制备方法。

本发明所提供的制备方法，包括以下步骤：

1)制备含90-100g/L丙烯酰胺单体和4-6g/L N，N’-亚甲基双丙烯酰胺单体的混合溶液，再向该混合溶液中加入NaCl至饱和，以NaCl不再溶解为止；