[发明专利]从中药等天然产物混合物备选库中筛选SARS冠状病毒主蛋白酶抑制剂的新方法

权利要求书

1、从川藏香茶菜备选样品中筛选SARS冠状病毒主蛋白酶抑制剂的方法， 其特征在于包括如下步骤：

A：测定川藏香茶菜备选样品对SARS冠状病毒主蛋白酶的抑制活性，将 SARS冠状病毒主蛋白酶的晶体与川藏香茶菜备选样品接触，得到SARS冠状病 毒主蛋白酶与小分子抑制剂复合体的晶体；SARS冠状病毒主蛋白酶晶体与川藏 香茶菜备选样品接触时，使用的方法为晶体浸泡的方法；

B：收集并分析步骤A中得到的复合体的晶体的X射线衍射数据，获得与 SARS冠状病毒主蛋白酶结合的小分子抑制剂的电子密度；

C：以步骤B中获得的与SARS冠状病毒的主蛋白酶结合的小分子抑制剂的 电子密度为基础，鉴定与SARS冠状病毒主蛋白酶结合的小分子抑制剂，获得 小分子抑制剂与SARS冠状病毒主蛋白酶复合体的精细三维结构；

D：测定小分子抑制剂对SARS冠状病毒主蛋白酶的抑制活性；

其中，所述SARS冠状病毒主蛋白酶晶体结晶条件为：1.8～12％的PEG 6000，3％二甲基亚砜，1mM DTT，pH5.0～PH6.0的100mM MES缓冲液以 及蛋白浓度为5～12mg/ml；

所述川藏香茶菜备选样品的制备方法包括如下步骤：

(a)、取一定量的川藏香茶菜，用乙醇溶液回流提取，合并提取液，浓缩得 浸膏；其中乙醇溶液与初级原料的用量质量比为6:1-12:1；所用乙醇溶液浓度为 70％-95％；

(b)、称取一定量步骤(a)中所得的浸膏，用双蒸水悬浮，用有机溶剂萃取， 分离有机溶剂相和水相；合并水相，备用；合并每次有机溶剂萃取物，蒸除其 中的有机溶剂，得到干膏状有机溶剂相样品，备用；其中浸膏与悬浮用双蒸水 的质量比为1:5-1:15；萃取用有机溶剂为乙酸乙酯，其体积与悬浮用双蒸水的体 积比为6:1-10:1；

(c)、蒸除步骤(b)中萃取后的水相部分的水中溶解的少量有机溶剂，用HP-20 型大孔树脂柱层析分离，依次用水和乙醇溶液为流动相洗脱；弃去水洗部分， 蒸除乙醇溶液洗脱部分的溶剂，得干膏状样品备用；其中所用乙醇溶液浓度为 50％；

(d)、上述步骤(b)中制得的干膏状有机溶剂相样品和步骤(c)中制得的干膏状 样品即为源自初级原料川藏香茶菜的2个备选样品；

步骤A中所述晶体浸泡方法中，浸泡液是用如下方法制备：

方法一、将步骤c制备得到的样品的DMSO溶解物10倍稀释至SARS冠状 病毒主蛋白酶晶体生长池液，13000—15000rpm高速离心，之后取上清液，得浸 泡液1，备用；

方法二、将步骤b制备得到的样品直接溶解于SARS冠状病毒主蛋白酶晶 体生长池液中，13000—15000rpm高速离心，之后取上清液，得浸泡液2，备用；

浸泡时，利用尼龙晶体环工具，将已生长好的SARS冠状病毒主蛋白酶的 晶体从结晶池液中取出，分别加入浸泡液1和2中以及相应的10倍稀释液中， 浸泡2—48小时。