[发明专利]植物内生菌的制备方法

说明书

所属领域：

本发明涉及一种从植物材料中富集内生微生物的方 法，也就是涉及一种植物内生菌的制备方法。

背景技术：

植物个体无论是一粒种子还是一棵参天大树，都是一 种相对复杂的生态环境，种类和丰度不同的微生物栖息其中；对于生 活在活的植物组织内部而对植物不产生直接负面影响的微生物，被统 称为植物内生菌。植物内生菌普遍存在于植物体而且种类繁多，除少 部分内生菌集中群居在植物的某些特定部位比如根瘤和冠瘿瘤以外， 绝大多数植物内生菌通常在植物体内分散而居，人们对这些内生菌的 栖息部位和种类多样性知之甚少。不仅如此，大部分环境微生物包括 为数众多的植物内生菌难以人工培养成活，因而不能通过纯培养进行 分离鉴定以及产物化学研究。为了运用内生菌宏基因组的研究策略发 掘植物内生菌的基因资源并开发其化合物产生的潜能，首要步骤是从 植物材料富集植物内生菌并去除大量植物遗传物质的干扰。相关的报 道仅有富集土壤微生物的方法，其原理是通过密度梯度离心去除土壤 杂质，本发明人曾采用此种原理的方法却不能从植物组织有效富集到 内生菌，这是因为所要去除的杂质存在本质不同，前者是土壤颗粒而 后者是植物遗传物质。为了达到从植物材料富集内生菌的目的，本申 请的发明人在2006年曾报道用纤维素酶和离析酶从植物叶片和种子 富集内生菌的方法(Journal of Applied Microbiology 100：830-837)。 后续研究发现该方法存在缺点，即酶作用时间较长，可能因某些微生 物的滋生而造成富集样品内生菌丰度偏差。

发明内容：

本发明的目的是克服上述已有技术的局限，提供一种 新的植物内生菌制备方法。

为了实现本发明的上述目的，本发明提供了如下的技术方案：

植物内生菌的制备方法，取植物材料经高速组织捣碎机匀浆，低 速离心200g×5min，取上清液加入卤盐氯化钠或氯化锂至终浓度 0.1％～3.0％，以重量/体积为单位，再加入表面活性剂十二烷基磺酸钠 或Triton X-100至终浓度0.01～2.0％，以重量/体积为单位，混匀，静 置1-2小时，取上清液5000g离心10分钟，得到沉淀为植物内生菌。

上述方法所使用的卤盐优选用一价阳离子卤盐，或二价阳离子卤 盐。

上述方法所使用的表面活性剂优选用离子型表面活性剂或非离 子型表面活性剂。

本发明的方法是基于一定量的植物材料和无菌水用高速组织捣 碎机处理，匀浆液经低速离心分离之后，用一定浓度的卤盐和表面活 性剂清除植物来源杂质包括细胞核、细胞器和胶质等，自然沉降后取 上清液经高速离心收集沉淀就可得到内生菌丰富而植物遗传干扰物 质甚少的富集样品。

具体实施方式：

下面结合本发明的实施例进一步来说明本发明的实质性内容，但 并不以此限定本发明。

实施例1：

取滑桃树茎皮40克，用自来水和蒸馏水洗净，加入300毫升无 菌水，用高速组织捣碎机18000rpm匀浆；用无菌纱布过滤去除未破 碎的组织与纤维，滤液用低速离心(200g×5min)分离去除沉淀；往 上清液中加入氯化钠至终浓度1.0％(w/v)以及十二烷基磺酸钠至终 浓度0.05％(w/v)，颠倒混匀并静置1小时，此时会有大量絮状沉淀 产生，不要扰动沉淀；小心吸取上清液至一新的灭菌离心管，5000g 离心10分钟，得到的沉淀即为内生菌富集样品。

实施例2：

取云南美登木新鲜叶片20克，用自来水和蒸馏水洗净，加入400 毫升无菌水，用高速组织捣碎机15000rpm匀浆；用无菌纱布过滤去 除未破碎的组织与纤维，滤液用低速离心(200g×5min)分离沉淀； 往上清液中加入氯化锂至终浓度0.6％(w/v)以及Triton X-100至终 浓度0.15％(w/v)，颠倒混匀并静置2小时，此时会有大量絮状沉淀 产生，不要扰动沉淀；小心吸取上清液至一新的灭菌离心管，5000g 离心10分钟，得到的沉淀即为内生菌富集样品。

实施例3：