[发明专利]三种泌尿生殖道感染病原物的联合检测基因芯片试剂盒

说明书

技术领域：

本发明涉及一种三种泌尿生殖道感染病原物的联合检测基因芯片试剂盒，属于生物技术领域。

背景技术：

在泌尿生殖道感染性病原物中，沙眼衣原体、解脲支原体、淋球菌的感染率最高。据我国有关部门统计，每年性病患者有400万人左右，并在近10年内以20-30％速度增长。其中，淋病排列首位，占性病的40.72％，非淋菌性尿道炎第三，占性病的21.85％，在非淋菌性尿道炎中，沙眼衣原体占40-50％，解脲支原体占20-30％，也就是说，沙眼衣原体、解脲支原体、淋球菌的感染占感染总数的一半以上，因此上述三种病原物在临床上通常需要同时检测。

诊断是疾病治疗的基础，当前对上述三种病原物的诊断主要依靠培养法、ELISA和PCR检测。这些方法中，培养方法周期长，灵敏度和准确度低；免疫方法只能在抗原和抗体产生后才能检测，对感染程度较低的患者不能达到早期检测；PCR方法存在假阳性和假阴性难以控制的问题，荧光实时定量PCR也存在单纯PCR的固有缺陷，并且仪器及相关检测试剂价格昂贵。

近几年发展起来的基因芯片技术，在感染性疾病检测领域有其特有的优势。本发明即采用基因芯片技术研制成功沙眼衣原体(Chlamydiatrachomatis，Ct)；解脲支原体(Ureaplasma urealyticum，Uu)；淋球菌(Neisseria gonorrhoeae，Ng)基因芯片联合诊断试剂盒。

发明内容：

本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种三种泌尿生殖道感染病原物的联合检测基因芯片试剂盒。

本发明的基因芯片试剂盒，包括基因芯片、检测试剂和检测方法3部分。

其中：

1.基因芯片

本发明的基因芯片由l8位点组成，包括沙眼衣原体(Chlamydiatrachomatis，Ct)、解脲支原体(Ureaplasma urealyticum，Uu)和淋球菌(Neisseria gonorrhoeae，Ng)的各5个特异的、保守的靶序列位点，2个阳性对照位点和一个阴性对照位点。用PCR方法扩增18个检测位点的DNA片段作为探针，用基因芯片点样仪打印在包被的载玻片上。点样时的矩阵按探针均匀分布和重复对称排列。即每种病原物的5个检测位点与另外的病原物的5个检测位点交替分布，一个阳性位点和15个检测位点组成4×4的小矩阵，4个这样的矩阵对称排列组成一个9×9的大矩阵，另外的一个阳性对照和一个阴性对照在9×9矩阵的对称轴上。同时使得每个小矩阵的阳性位点位于大矩阵的4个角上(见附图1)。

2.检测试剂

本发明的检测试剂如下：

试剂1：DNA提取试剂1XTE

试剂2：扩增试剂，包含PCR扩增过程的各种试剂

试剂3：红色标记物，比如dUTP-cy5

试剂4：绿色标记物，比如dUTP-cy3

试剂5：Taq DNA聚合酶

试剂6：杂交液，常规的杂交液即可

试剂7：20XSSC

试剂8：10％SDS

四蒸水0.2ml薄壁管

1.5ml离心管

滤纸(120mm×40mm定性滤纸)

上述试剂的用量根据包装规格确定。

3.检测方法

本发明用常规的临床方法取泌尿生殖道的分泌物，并用常规方法提取DNA。用针对检测靶位点序列和对照位点的特异PCR引物扩增检测样本DNA，检测引物设计如图2所示，扩增反应试剂中加入阳性对照模板，而不加阴性对照模板，扩增的同时将红色标记物标记到扩增产物中去；同时与检测反应平行作一空白对照扩增反应，空白对照与检测反应的试剂配方一致，只是用绿色荧光代替红色荧光标记物，并用对照处理替换检测样本DNA。检测扩增产物与对照扩增产物按比例(见具体实施方式)混合后与芯片杂交。根据杂交信号判断样本中是否含有被检病原物，或含有甚么样的被检病原物。

本发明的优点：

1.基因芯片诊断能同时检测沙眼衣原体、解脲支原体和淋球菌，减少检测反应的次数，降低检测成本；

2.可同时检测每种病原物的5个靶位点，有效地减少因个体差异或单位点检测的失误引起的检测假阴性。

3.本发明结合了PCR的高灵敏度和杂交反应的高特异性。同时加上荧光标记，检测灵敏度较PCR方法的检测限降低2-3个数量级，可达10¹-10²病原物细胞/ml。

4.由于有足够的容量空间，可以设置各种对照，消除系统误差和控制检测系统污染。